HAp-Col-CTS仿生納米纖維對(duì)iPSC-MSCs的成骨分化誘導(dǎo)作用研究.pdf

1、利用仿生生物材料支架復(fù)合干細(xì)胞來(lái)修復(fù)和再生各類傷病組織或器官，是近年來(lái)組織工程與再生醫(yī)學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本文主要目的是研究通過(guò)電紡絲技術(shù)制備羥基磷灰石/膠原/殼聚糖（HAp/Col/CTS）納米纖維支架來(lái)仿生天然骨組織的組分及納米纖維結(jié)構(gòu)，然后探索該支架對(duì)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（iPSC-MSCs）的體外成骨誘導(dǎo)作用以及體內(nèi)骨缺損的修復(fù)和再生功效。
　　作為一種新的干細(xì)胞體系，iPSCs是由體細(xì)胞重編程而來(lái)，并具有強(qiáng)大

2、自我更新能力和分化潛能的多能干細(xì)胞。與胚胎干細(xì)胞相比， iPSCs具有可建立大批量同源細(xì)胞而無(wú)倫理爭(zhēng)議和免疫排斥性的優(yōu)勢(shì)；與間充質(zhì)干細(xì)胞相比，iPSCs來(lái)源廣泛，取材對(duì)患者無(wú)痛苦。而由iPSCs而來(lái)的MSCs干細(xì)胞（即iPSC-MSCs），不僅增殖能力強(qiáng)，能夠表達(dá)MSCs的標(biāo)志性基因和具備三系分化能力，而且相對(duì)于iPSCs其分化方向相對(duì)可控，具有較高的生物安全性（致瘤性低）。這些特點(diǎn)使iPSC-MSCs在骨組織工程研究領(lǐng)域具有更大的研究

3、和應(yīng)用價(jià)值。但是，如何在體內(nèi)、體外環(huán)境下誘導(dǎo)其形成特異骨組織細(xì)胞是關(guān)鍵問(wèn)題。由于天然的骨基質(zhì)是骨/干細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境，并直接調(diào)控
　　著細(xì)胞的各種行為，利用精確仿生骨細(xì)胞生存微環(huán)境的生物材料支架來(lái)誘導(dǎo)iPSC-MSCs的成骨分化，將是一種最為直接有效的調(diào)控方式。
　　本研究選取電紡HAp/Col/CTS納米纖維來(lái)仿生天然骨基質(zhì)組成和微-納米結(jié)構(gòu)。其中，HAp是自然骨中主要的無(wú)機(jī)成分，降解后的鈣離子和磷酸根離子能促進(jìn)骨組織

4、修復(fù)，具有骨傳導(dǎo)性和良好的成骨性能；Col是天然骨基質(zhì)的主要有機(jī)成分，生物相容性優(yōu)良，可與HAp在納米尺度上復(fù)合形成HAp/Col復(fù)合納米纖維，形成構(gòu)建多級(jí)結(jié)構(gòu)骨組織的基本結(jié)構(gòu)單元；CTS是一種多糖生物大分子，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與廣泛存在于胞外基質(zhì)中的氨基聚糖（GAG）類似，且其生物降解特性可通過(guò)酰基含量進(jìn)行調(diào)控，一定程度上彌補(bǔ)了Col成分的降解特性不易控制的不足。因此，通過(guò)將這三種材料復(fù)合制得的納米纖維不僅在組分上與骨基質(zhì)的組成近似，而且具

5、有聚合材料納米纖維超結(jié)構(gòu)，這為形成具有良好生物相容性、生物活性（如骨傳導(dǎo)性與骨誘導(dǎo)性）以及優(yōu)異的機(jī)械強(qiáng)度的高仿生骨組織工程支架提供了可能。理論上推測(cè)，我們預(yù)期該仿生活性HAp/Col/CTS納米纖維支架將有利于iPSC-MSCs的生長(zhǎng)、黏附及向成骨細(xì)胞定向分化。
　　為此，在本研究中，我們首先采用原位共沉淀方法合成了HAp/CTS納米復(fù)合材料，進(jìn)而加入15wt％的Col與15 wt％的PEO（均相對(duì)于CTS的質(zhì)量比）并在乙酸水溶液

6、中混合均勻后，在25-30％的濕度和30-35?C的溫度條件下進(jìn)行電紡絲。通過(guò)表征分析發(fā)現(xiàn)，電紡制備的HAp/Col/CTS復(fù)合纖維的形貌良好，直徑范圍為190-230 nm，并且HAp在纖維中的分布也比較均勻。同時(shí)復(fù)合納米纖維中各成分之間
　　存在著較強(qiáng)的相互作用，與純Col相比其熱穩(wěn)定性與力學(xué)性能都有所提高，其中分解溫度由純Col的172?C上升至235?C，拉伸強(qiáng)度獲得增強(qiáng)達(dá)2.54 MPa，能夠用于骨組織工程支架。

7、　　其次，通過(guò)對(duì)小鼠源iPSCs先經(jīng)過(guò)擬胚體階段懸浮培養(yǎng)后再進(jìn)行貼壁誘導(dǎo)，我們獲得了iPSC-MSCs種子細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，第四代以后的iPSC-MSCs在Nanog, Oct3/4, Sox2這三種多性能基因表達(dá)上維持在一個(gè)較為平緩的低水平，既可以保證細(xì)胞的安全性又使其具備較強(qiáng)的增殖能力。并且該細(xì)胞的MSCs標(biāo)志物CD90, CD29, CD44分別高達(dá)99.62％,99.14％,86.12％，而造血干細(xì)胞的標(biāo)志物CD45僅為0.29％

8、。證明iPSC-MSCs既具備iPSCs的同源性強(qiáng)、來(lái)源廣、體外分化能力強(qiáng)，又具備MSCs的安全性、中胚層分化性并可定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的特性。因此iPSC-MSCs可作為一種優(yōu)良的種子細(xì)胞用于本課題的骨組織工程研究中。
　　接著，對(duì)iPSC-MSCs在CTS, HAp/CTS, HAp/Col/CTS納米纖維支架及組織培養(yǎng)板（TCP）上培養(yǎng)不同時(shí)間后，我們考察了其形貌特征、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移及成骨分化等特性，結(jié)果表明：HAp/

9、Col/CTS對(duì)iPSC-MSCs具有很強(qiáng)的細(xì)胞親和力，能夠促進(jìn)這些細(xì)胞的鋪展與增殖，說(shuō)明此材料具有良好的細(xì)胞相容性。骨相關(guān)基因Runx2, Ocn, Alp, Col的高表達(dá)如Runx2在HAp/Col/CTS納米纖維膜上的表達(dá)量分別是TCP、CTS納米纖維膜與 HAp/CTS納米纖維膜上的3.82、3.29、2.67倍，標(biāo)志性蛋白（RUNX2與OCN）的高陽(yáng)性率以及分泌蛋白（ALP與Col）的過(guò)量表達(dá)均證明該仿生支架材料具有優(yōu)良的成

10、骨誘導(dǎo)性。
　　最后，以小鼠顱骨缺損為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，我們研究了植入iPSC-MSCs復(fù)合HAp/Col/CTS仿生納米纖維支架對(duì)骨缺損的修復(fù)功效。通過(guò)雙源CT影像學(xué)、骨密度檢測(cè)以及HE染色檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)復(fù)合iPSC-MSCs的HAp/Col/CTS仿生納米纖維支架在小鼠顱骨缺損模型中能夠刺激骨組織再生，在植入六周之后該組別的新生骨密度分別是空白對(duì)照組、CTS納米纖維組、HAp/CTS納米纖維組與HAp/Col/CTS納米纖維組的3.3

11、5、2.91、2.88和2.14倍，均表現(xiàn)出極顯著性差異（P＜0.01），呈現(xiàn)出最優(yōu)的骨缺損修復(fù)效果，證明iPSC-MSCs/HAp/Col/CTS復(fù)合體具有突出的修復(fù)骨缺損潛力。
　　總之，iPSCs在實(shí)現(xiàn)個(gè)性化的治療領(lǐng)域有著巨大的優(yōu)勢(shì)和潛能，本研究首次利用HAp/Col/CTS納米纖維支架來(lái)誘導(dǎo)iPSC-MSCs的成骨分化，結(jié)果證明該仿生支架可顯著誘導(dǎo)iPSC-MSCs向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)功能表達(dá)，對(duì)骨缺損的修復(fù)效果明顯，具有