關(guān)于亞硝酸鈉對地鼠卵巢生殖毒性形態(tài)學(xué)相關(guān)性研究.pdf

1、卵泡是卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟的微環(huán)境。因此卵泡發(fā)育機(jī)理倍受國內(nèi)外生殖生物學(xué)家的關(guān)注[1-3]。Ca2+是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中十分重要的第二信使，它直接或間接地通過鈣調(diào)蛋白及其鈣結(jié)合蛋白調(diào)控細(xì)胞中多種重要的酶及功能蛋白，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、分化、凋亡等生命過程[4-5]。胞質(zhì)自由Ca2+濃度的變化主要是通過Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括存在于質(zhì)膜及胞內(nèi)鈣庫中的鈣通道(Calciumchannel)、 Ca2+泵(Ca2+pump)及Ca2+/H+反向

2、轉(zhuǎn)運(yùn)子(Ca2+/H+antiporter)等的作用來實(shí)現(xiàn)的。其中，鈣通道是存在于質(zhì)膜或細(xì)胞器膜的大分子蛋白質(zhì)。鈣通道的開放或關(guān)閉調(diào)節(jié)著胞質(zhì)自由Ca2+濃度，從而影響機(jī)體細(xì)胞的某些生理功能[6]。 本實(shí)驗(yàn)是通過外界環(huán)境因素亞硝酸鈉(Sodium nitrite)的作用，影響孕鼠卵巢形態(tài)學(xué)和顆粒細(xì)胞質(zhì)膜鈣通道蛋白表達(dá)變化，導(dǎo)致卵母細(xì)胞不能與顆粒細(xì)胞保持正常的信息溝通和物質(zhì)交換，致使卵泡正常發(fā)育成熟和排卵受阻，以此來觀察亞硝酸鈉的生

3、殖毒性反應(yīng)。本文以孕鼠卵巢形態(tài)學(xué)和粒細(xì)胞質(zhì)膜鈣通道蛋白為研究對象，闡述了應(yīng)用外源亞硝酸鈉后孕鼠卵巢形態(tài)學(xué)和顆粒細(xì)胞質(zhì)膜鈣通道蛋白表達(dá)水平改變，揭示了亞硝酸鈉在地鼠的生殖毒性作用機(jī)理。 1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：選擇未經(jīng)產(chǎn)雌性成熟金黃地鼠160只，隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組分別腹腔注射不同濃度的亞硝酸鈉(2、4、8mg/kg·d)，對照組給予生理鹽水。采用光鏡及電鏡的方法觀察卵泡及顆粒細(xì)胞的形態(tài)改變； 2、體外實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)并對培

4、養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行鈣通道蛋白免疫印跡半定量實(shí)驗(yàn)以觀察鈣通道蛋白的表達(dá)量。 3、合籠交配試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物80只均按1∶1比例雌雄合籠行交配試驗(yàn)，觀察3個(gè)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物發(fā)情交配和生育能力，對照組同步做對照觀察。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.亞硝酸鈉處理后卵泡的光鏡形態(tài)學(xué)變化給予亞硝酸鈉4mg/(kg·d)和8mg/(kg·d)的負(fù)荷5天后，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ剖腹觀察卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)與對照組動(dòng)物比較變化不大，沒有統(tǒng)計(jì)意義。但實(shí)驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組停藥后于第6天取卵巢

5、觀察，可見卵巢毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張充血，卵泡顆粒細(xì)胞排列紊亂；而對照組停藥同步觀察，卵巢的形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。 2)亞硝酸鈉處理后卵泡的電鏡形態(tài)學(xué)變化給予亞硝酸鈉8mg/(kg·d)負(fù)荷5天后，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ組和Ⅱ組取卵巢觀察與對照組比較沒有統(tǒng)計(jì)意義。但在實(shí)驗(yàn)Ⅲ組取卵巢觀察，可見透明帶變窄以及顆粒細(xì)胞在透明帶內(nèi)的微絨毛減少，對照組卵巢觀察可見透明帶以及顆粒細(xì)胞在透明帶中的微絨毛正常；實(shí)驗(yàn)Ⅲ組顆粒細(xì)胞的線粒體、脂滴和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少；對照組顆粒細(xì)胞

6、的線粒體、脂滴含量和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表現(xiàn)正常。 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 在體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)追加不同負(fù)荷劑量的亞硝酸鈉24小時(shí)后，培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞相應(yīng)的鈣通道蛋白表達(dá)呈計(jì)量依賴性下降(P<0.05，vs對照組)。根據(jù)免疫印跡法測定卵巢顆粒細(xì)胞鈣通道蛋白半定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，卵巢顆粒細(xì)胞鈣通道蛋白表達(dá)(OD，-x±s)：對照組為81.76±4.33；實(shí)驗(yàn)Ⅰ組為66.49±6.05,實(shí)驗(yàn)Ⅱ組44.42±4.05；實(shí)驗(yàn)組Ⅲ為25.27±3.02，顆

7、粒細(xì)胞鈣通道蛋白含量呈梯度下降。 合籠交配試驗(yàn)結(jié)果： 腹腔內(nèi)注射不同負(fù)荷劑量的亞硝酸鈉5天后，相應(yīng)的地鼠1∶1合籠交配后生仔率也呈現(xiàn)計(jì)量依賴性下降。實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水組之間的生育情況有明顯的差異(P>0.05)。注射亞硝酸鈉后生育抑制情況如下：對照組合籠交配20只，生仔20只；實(shí)驗(yàn)組Ⅰ合籠交配20只，生仔16只；實(shí)驗(yàn)組Ⅱ合籠交配2只，生仔8只；實(shí)驗(yàn)組Ⅲ合籠交配20只，生仔1只，(P<0.05，vs對照組)。 上述實(shí)

8、驗(yàn)結(jié)果分析，選擇亞硝酸鈉的劑量濃度是實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組地鼠接受了不同濃度的亞硝酸鈉時(shí)，地鼠卵巢細(xì)胞變化反應(yīng)出現(xiàn)了不同結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，當(dāng)機(jī)體負(fù)荷較大濃度亞硝酸鈉時(shí)可能會(huì)影響細(xì)胞基質(zhì)蛋白合成而導(dǎo)致細(xì)胞粘著、遷移、定位的改變，因此造成了卵巢毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血和卵泡顆粒細(xì)胞排列定位紊亂；亞硝酸鈉影響了細(xì)胞膜Ca2+通道蛋白的表達(dá)，出現(xiàn)了濃度依賴性抑制，Western Blot定量分析了實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組蛋白含量，明顯發(fā)生梯度降低；

9、實(shí)驗(yàn)Ⅲ組呈極弱陽性表達(dá)(p<0.01，vs對照組)，從而影響了Ca2+作為細(xì)胞信號由胞外向胞內(nèi)的傳遞，干擾了細(xì)胞生理調(diào)控活動(dòng)，抑制了顆粒細(xì)胞分泌卵膜(zone pellucida)和合成結(jié)構(gòu)蛋白，造成透明帶分泌減少而變窄，細(xì)胞內(nèi)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、脂滴和細(xì)胞表面微絨毛減少，顆粒細(xì)胞這些形態(tài)改變影響了卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)驗(yàn)組和對照組合籠交配生育實(shí)驗(yàn)表明，亞硝酸鈉濃度與地鼠生育能力抑制呈正比。較大劑量的亞硝酸鈉能干擾地鼠生育能