人源性飼養(yǎng)層制備的標準化操作.pdf

1、人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)自發(fā)現以來一直以其不斷自我更新和分化多潛能性特點吸引著眾多關注的目光。長期穩(wěn)定的得到未分化狀態(tài)hESCs克隆是進行各項研究的前提。以小鼠胚胎成纖維細胞制作飼養(yǎng)層(mouse Feeder cells以下簡稱鼠飼養(yǎng)層)共培養(yǎng)的方法得到hESCs歷史最為悠久，也正因如此，它們的穩(wěn)定性得到了更多的認可。然而，使用最為普遍的鼠飼養(yǎng)層是不符合臨床應用的要求的，真正實

2、現hESCs的臨床應用就不能使用動物來源的飼養(yǎng)層，為此人類胚胎成纖維細胞(human embryonicfibroblasts．hEFs)制備的飼養(yǎng)層(以下簡稱人飼養(yǎng)層)成為我們目前的最佳選擇。要長期進行大中型hESCs培養(yǎng)就必須先有穩(wěn)定的飼養(yǎng)層制作工藝和足夠量的人成纖維細胞。本研究針對人源性飼養(yǎng)層制作過程中出現的問題進行了初步研究，并由此為依據建立了標準化的人飼養(yǎng)層制備流程。 目的： 1.采集人成纖維細胞，用于人飼養(yǎng)層

3、的制備； 2.針對本室人飼養(yǎng)層制作過程中出現的問題進行研究：是否一定需要使用動物血清；成纖維細胞在體外培養(yǎng)的生長曲線中各期(滯后期，對數生長期，平臺期，衰退期)制備飼養(yǎng)層的效果如何；飼養(yǎng)層密度對hESCs培養(yǎng)效果有沒有影響，不同個體來源的成纖維細胞制備的飼養(yǎng)層有無差異。為標準化制備流程的建立提供依據； 3.建立標準化人飼養(yǎng)層制備程序，為hESCs在人飼養(yǎng)層體系下的長期培養(yǎng)提供指導。 材料和方法： 實驗材料

4、來自2-4個月的自愿放棄妊娠的人工流產完整胚胎。(長沙市婦幼保健醫(yī)院提供)采用機械分離方法從胚胎采集皮膚和肌肉，通過組織塊培養(yǎng)分離hEFs，然后胰酶消化進行傳代擴增。收集的不同胚胎個體來源的每株hEF細胞，通過細菌，衣原體，支原體培養(yǎng)以及支原體hoechst33258染液染色進行微生物污染檢測。此外，每株hEF細胞還進行了核型檢測，并且在培養(yǎng)到p7時進行絲裂霉素處理制作飼養(yǎng)層，然后在這些飼養(yǎng)層上種植chHES 20和chHES 22克隆

5、，D/F ES(參見后文)培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天換液，6天后進行AKP染色檢測克隆的分化情況，以確定收集到的hEF細胞株是否適用于制備飼養(yǎng)層。針對本實驗室以往在人飼養(yǎng)層體系中培養(yǎng)hESCs出現的問題，進行以下研究： 1.以hi-DMEM為基礎培養(yǎng)基，針對胎牛血清(Fetal Bovine Serum．FBS)及其可能的替代產品：人血清白蛋白(Human Serum Albumin．HSA)、血清替代補充成分(Synthesis Ser

6、um Subtituent，SSS)對hEF-dly-2 p7擴增效率的影響進行實驗比較，選擇其中最適的培養(yǎng)體系； 2.以chHES 20和chHES 22克隆分化率為指標，研究傳代后hEF-dly-2 p7在體外培養(yǎng)的生長曲線中各期(滯后期，對數生長期，平臺期，衰退期)制備飼養(yǎng)層的效果； 3.以chHES 20和chHES 22克隆分化率為指標，在利用hEF-dly-2p7制作飼養(yǎng)層的過程中尋找一個最佳飼養(yǎng)層鋪皿密度；

7、 4.比較在3株不同胚胎個體來源的飼養(yǎng)層(mitc hEF-dly-2 p7，mitc hEF-dly-8 p7，mitc hEF-dly-9 p7)上培養(yǎng)的clfftES 20和chHES 22克隆分化率是否有差異。 結果： 共采集到hEF細胞10株，均沒有細菌，支、衣原體污染。其中9株能夠進行常規(guī)擴增，并且這9株細胞均能在制成飼養(yǎng)層后支持chHES 20和chHES 22克隆的生長。 1.在FBS,H

8、SA,SSS作為培養(yǎng)基添加物進行hEF的培養(yǎng)后，發(fā)現添加10﹪HAS，10﹪SSS，20﹪SSS的培養(yǎng)體系下，hEF根本無法擴增，添加10﹪FBS的培養(yǎng)體系仍然是最佳選擇； 2.傳代后hEF-dly-2 p7在體外培養(yǎng)至指數生長期結尾時，用來制作飼養(yǎng)層效果最好，hESCs克隆分化率僅為1.7±2.3﹪； 3.D/F ES培養(yǎng)基的常規(guī)體系下培養(yǎng)hESCs，人飼養(yǎng)層的最佳細胞鋪皿密度為3×10<'4>個/cm<'2>；

9、 4.在不同株次來源的飼養(yǎng)層上生長的hESCs克隆分化率差別不大。 附：人源性飼養(yǎng)層制備的標準化操作流程。 結論： 截止本文完成時，已采集到10株不同標本來源的人胚胎皮膚來源的成纖維細胞，其中有一株由于數量太少沒有進行研究，其余9株均符合飼養(yǎng)層制作要求。如果凍存對細胞的壽命沒有影響，每株細胞經過擴增和凍存可供本室現規(guī)模的人源性飼養(yǎng)層制作至少26年； 1.尚未找到合適的FBS替代物，但是在ESCs克隆種植

10、前使用磷酸緩沖溶液(phosphate-buffered saline，PBS)對飼養(yǎng)層進行洗滌可以清除FBS。 2.以本室常用的1∶20比例進行傳代擴增時，hEF-dly-2 p7需要10天的時間經歷滯后期(1天)，指數生長期(5天)，平臺期(4天)最后到達衰退期，實驗數據表明hEF-dly-2 p7指數生長期結束時，制作的飼養(yǎng)層效果最好，因此在hEF在制備飼養(yǎng)層前應擴增6天。 3.D/F ES培養(yǎng)基的常規(guī)體系下，人飼

11、養(yǎng)層細胞鋪皿密度對hESCs的培養(yǎng)影響很大：密度過稀或者過密都將導致hESCs克隆嚴重分化，密度過稀時，hESCs克隆細胞從中央開始變形，細胞呈扁平狀，核質比變??；過密時，hESCs克隆變厚，細胞從克隆周邊開始堆積，最后中央細胞變形分化。 4.在隨機挑選的三株不同胚胎個體來源的飼養(yǎng)層上生長的hESCs克隆分化率差別不大。說明通過本研究使用的方法得到的hEF性質穩(wěn)定，都能較好地支持hESCs的生長。 通過規(guī)范人源性飼養(yǎng)層制