達比加群對凝血酶誘導的人氣道平滑肌細胞外基質沉積的影響及機制探討.pdf

1、Huber和Koessler在九十多年前對致死性哮喘的經(jīng)典描述中首次提出了氣道重塑的概念。臨床上，氣道重塑是引起哮喘患者出現(xiàn)不可逆性通氣功能障礙的罪魁禍首。
　　研究表明，增厚的氣道平滑肌(ASM)層是引起哮喘患者產(chǎn)生氣流受限的首要原因。細胞外基質(ECM)在正常氣道內起物理支撐作用，哮喘中氣道平滑肌細胞(ASMC)異常分泌的ECM不僅會加劇氣道狹窄，還會反向促進ASMC異常增殖及分泌，形成氣道重塑的惡性循環(huán)。因此，ASMC分泌E

2、CM是哮喘氣道重塑防治的重要靶點。
　　肺內凝血是近年哮喘防治的研究熱點。凝血系統(tǒng)中的關鍵蛋白酶凝血酶可以通過與特定的受體結合，發(fā)揮促炎、促增殖、促遷移等非凝血功能。凝血酶受體（PARs）中PAR-1與PAR-2在肺損傷及炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，以PAR-1關系尤為密切。PAR-1在氣道多種結構細胞如肺成纖維細胞、ASMC、上皮細胞的細胞膜上均有表達。目前尚未有報道表明凝血酶-PAR-1對氣道ECM重塑的影響。
　　達比加

3、群酯是一種新型高效的直接凝血酶抑制劑，是最前沿的口服抗凝藥物?；A研究發(fā)現(xiàn)，達比加群對凝血酶-PAR1介導的非凝血功能同樣具有抑制作用。
　　據(jù)此，我們推測凝血酶可能通過與ASMC胞膜上的PAR-1結合，激活下游ERK1/2信號通路，促進ECM沉積;而達比加群可以抑制這一效應。
　　目的:
　　1.分離培養(yǎng)原代人氣道平滑肌細胞并進行鑒定;
　　2.明確凝血酶對ASMC ECM沉積的作用;觀察PAR-1受體抑制劑S

4、CH79797及ERK1/2信號通路抑制劑U0126對這一作用的影響;
　　3.明確凝血酶對ASMC ERK1/2信號通路磷酸化水平的影響;觀察SCH79797及U0126對這一作用的影響;
　　4.明確達比加群干預凝血酶后，ASMC ECM沉積及ERK1/2信號通路磷酸化水平的變化。
　　方法:
　　1.取南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院胸外科肺葉切除術患者標本，采用本課題組成熟的組織塊貼壁法分離培養(yǎng)原代人氣道平滑肌細胞。

5、采用特異性免疫熒光染色技術進行細胞鑒定。
　　2.選擇RT-PCR及Western blot技術分別檢測不同干預后ASMC ECM基因及蛋白的表達水平。
　　3.選擇Western blot技術檢測不同干預后ASMC ERK1/2的磷酸化水平變化。
　　4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計:SPSS20.0軟件統(tǒng)計，采用One-Way ANOVA法進行分析，確定方差齊且組間差異有統(tǒng)計學意義后采用LSD法進行多重比較。P＜0.05，差異即有統(tǒng)計

6、學意義。
　　結果:
　　(1)原代人氣道平滑肌細胞在光鏡下呈長梭形，生長融合后呈現(xiàn)“峰谷征”;經(jīng)抗α-SMA抗體進行特異性染色后，可見胞質內均勻分布綠色熒光。
　　(2)①用遞增濃度的凝血酶(0.1-10U/ml)刺激細胞24h，COL-Ⅰα1的表達均顯著增加(P＜0.01)，1.0U/ml達最大效應;②用1.0U/ml的凝血酶刺激細胞不同時間(12-72h)，COL-Ⅰα1的表達均顯著增加(P＜0.01)，并在48

7、h到達峰值;③用凝血酶(1.0U/ml)刺激細胞12h，COL-Ⅰα1、多功能蛋白聚糖、纖連蛋白mRNA表達均顯著增加(P＜0.01)，而膠原蛋白Ⅲ、層黏連蛋白α1、α2mRNA表達與對照組相比無明顯差異;④SCH79797及U0126均能顯著抑制凝血酶誘導的COL-Ⅰα1(P＜0.01)及ECM基因(P＜0.05)的表達增加。
　　(3)①凝血酶(1.0U/ml)刺激細胞不同時間(5-60min)，ERK1/2磷酸化水平顯著上升

8、(P＜0.05)，呈早期快速磷酸化模式，5min達最大效應;②SCH79797及U0126均能顯著抑制凝血酶誘導的ERK1/2快速磷酸化(P＜0.01)。
　　(4)達比加群提前干預細胞30min后，與對照組相比，能顯著抑制凝血酶誘導的COL-Ⅰα1(P＜0.01)、ECM基因(P＜0.05)的表達增加、并能抑制凝血酶誘導的ERK1/2快速磷酸化（P＜0.01）。
　　結論:
　　1.采用組織塊貼壁法可成功分離培養(yǎng)出原