多重耐藥弗氏檸檬酸桿菌P10159和噬菌體IME-CF2的測(cè)序和基因組學(xué)研究.pdf

1、弗氏檸檬酸桿菌是人體腸道正常菌群，也是條件致病菌，能引起免疫力低下人群患病。弗氏檸檬酸桿菌自發(fā)現(xiàn)之初就表現(xiàn)出對(duì)常用的抗生素耐受，抗生素治療只能抑制其生長(zhǎng)。此外，該菌對(duì)表面活性劑、化學(xué)消毒劑、紫外線照射等具有一定抵抗作用。因此，不易將其從醫(yī)療設(shè)備上清除干凈，是院內(nèi)感染重要病原菌之一，重要性僅次于銅綠假單胞菌。當(dāng)前，抗生素藥物的研發(fā)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上細(xì)菌獲得耐藥的速度，耐藥細(xì)菌特別是多重耐藥病原菌給臨床抗感染治療帶來極大挑戰(zhàn)。臨床亟待尋找抗生素

2、可替代品，用于耐藥病原菌的防控和治療。有古老研究歷史的噬菌體治療此時(shí)展現(xiàn)出許多優(yōu)勢(shì)，是一種潛在治療方案，重新獲得人們的關(guān)注。
　　高通量測(cè)序技術(shù)（HTS），又叫下一代測(cè)序技術(shù)（NGS），具有通量高、速度快、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，為基因組學(xué)的發(fā)展提供了重要支撐，是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)等行業(yè)研究的重要工具。基因組完整序列的獲取對(duì)研究遺傳、進(jìn)化、變異、基因組成、基因調(diào)控等具有重要意義。當(dāng)前，市場(chǎng)主流的二代測(cè)序平臺(tái)有Roche454、Illumina

3、的 Hiseq及 Miseq、Life的 Ion Torrent。其中Illumina占據(jù)絕大部分市場(chǎng)，其突出優(yōu)點(diǎn)是通量高、準(zhǔn)確度高。Ion Torrent測(cè)序速度最快，Roche454單條Reads序列讀長(zhǎng)最長(zhǎng)，它們都有同聚性錯(cuò)誤的缺點(diǎn)。以上測(cè)序儀在不同的應(yīng)用領(lǐng)域有其優(yōu)勢(shì)與不足。
　　本實(shí)驗(yàn)針對(duì)分離于醫(yī)院食管癌患者尿液的一株多重耐藥弗氏檸檬酸桿菌，首先測(cè)定其耐藥譜和生化特性。然后，使用Ion Torrent對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序研

4、究和基因組學(xué)分析。為解決基因組序列拼接中因重復(fù)序列所致斷裂問題，我們使用Shotgun和Mate-Pair兩種測(cè)序方法。序列組裝使用Newbler v2.8，由于其組裝原理基于序列相似性比對(duì)，過多數(shù)據(jù)反而不利于組裝。經(jīng)反復(fù)嘗試，我們推薦使用約30倍覆蓋倍數(shù)的數(shù)據(jù)用于組裝。ContigScape軟件用于Contigs關(guān)聯(lián)信息展示，并使用參考序列進(jìn)行片段定位?；蚪MGap使用Gapfiller填補(bǔ)，針對(duì)其中不能填補(bǔ)的Gap，兩端設(shè)計(jì)引物，通

5、過PCR擴(kuò)增獲取該Gap序列。最終，獲取C.freundii P10159基因組全序，長(zhǎng)5080321bp, GC含量51.7％?；蚪M編碼4768個(gè)CDSs，24個(gè)rRNA和69個(gè)tRNA。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其余三株弗氏檸檬酸桿菌（C.freundii CAV1741、C.freundii CAV1321和C.freundii CFNIH1）全基因組序列，與本測(cè)序菌株P(guān)10159進(jìn)行比較基因組學(xué)分析。結(jié)果顯示，4株弗氏檸檬酸

6、桿菌同源性較高，同源區(qū)域較多。C.freundii P10159相較于其他三株基因組有一個(gè)大片段顛倒突變（2.4~3.2Mbp），與C.freundii CAV1231株同源性最高。進(jìn)一步抽提以上四株弗氏檸檬酸桿菌蛋白序列，進(jìn)行同源蛋白比對(duì)分析。4株弗氏檸檬酸桿菌之間共有同源基因3395個(gè)，表明它們之間具有相對(duì)較高的同源性。C.freundii P10159與C.freundii CAV1321、C.freundii CAV1741和C

7、.freundii CFNIH1分別具有3613、3606和3488個(gè)同源基因。C.freundii P10159具有最多的特有基因787個(gè)，與其他三株差別最大?；?個(gè)管家基因和1個(gè)16S rRNA序列進(jìn)化樹分析顯示，上述四株弗氏檸檬酸桿菌處于同一進(jìn)化分支，能與大腸桿菌及沙門氏菌分開。本文第二章成功從醫(yī)院污水中分離到一株弗氏檸檬酸桿菌毒性噬菌體IME-CF2，電鏡照片顯示該噬菌體呈典型的二十面體結(jié)構(gòu)，具有一收縮的尾部，形態(tài)類似肌尾噬菌