rTMP-GH融合蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達與純化及其促血小板生成作用研究.pdf

1、血小板減少癥在臨床上較為常見，目前用于救治血小板減少癥的藥物不僅種類少，而且還存在各種缺點，臨床上急需新型、高效升血小板藥物。巨核細胞是血小板生成的前體細胞，調(diào)控巨核細胞的增殖與分化是促進血小板生成的最有效手段1。 血小板生成素(thrombopoietin，TPO)又稱巨核細胞生長發(fā)育因子(MGDF)或血小板生長因子(TSF)，是巨核細胞-血小板系統(tǒng)最重要的調(diào)控因子和促進血小板生成最主要的細胞因子。TPO通過與其受體c-Mp

2、1結(jié)合而刺激巨核細胞的增殖與分化，并促進血小板的生成和釋放，控制循環(huán)血中血小板的數(shù)量和功能2。但是，由于通過基因工程制備并經(jīng)聚乙二醇化的重組人MGDF在臨床試用過程中有中和性TPO抗體現(xiàn)象發(fā)生，美國FDA至今未批準(zhǔn)重組人TPO基因工程產(chǎn)品進入臨床。TPO模擬肽(thrombopoietinmimeticpeptide,TMP)是一種與天然TPO生物學(xué)活性相似但又與其完全不同源的短肽，體外實驗顯示TMP與巨核細胞表面的TPO受體c-Mp1

3、具有很高的親和力，體內(nèi)動物實驗未發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和性TPO抗體3。但是，由于TMP分子量非常小，不易通過基因工程方法進行制備，同時在血液中也容易被降解，因此使得它在臨床上的推廣應(yīng)用受到很大限制。 近來研究發(fā)現(xiàn)，人生長激素(humangrowthhormone，hGH)具有顯著刺激巨核/巨核祖細胞增殖分化和促進血小板生成的作用4。然而，由于hGH的生物學(xué)功能比較廣泛，其在促進巨核細胞增殖分化和血小板生成作用時的生物利用度相對較

4、低。為此，我們通過基因重組技術(shù)將TMP與hGH進行融合，目的是使hGH在TMP引導(dǎo)下靶向聚集于巨核/巨核祖細胞的周圍，從而提高hGH在促進血小板生成時的生物利用度，另一方面，也使TMP得以通過基因工程方法進行制備。 在本實驗中，我們首先將編碼rTMP-GH的基因序列克隆至原核表達載體pMAL-p2x中，通過與麥芽糖結(jié)合蛋白MBP進行融合而實現(xiàn)rTMP-GH在大腸桿菌中的高效、可溶性表達，經(jīng)過柱層析純化、Xa因子酶切和再次純化，

5、最終獲得重組融合蛋白rTMP-GH，經(jīng)多方面的體外生物學(xué)活性驗證后，進一步觀察了該融合蛋白對急性重度骨髓型放射病小鼠血小板減少的促恢復(fù)作用。所取得的主要研究結(jié)果與結(jié)論如下： 1.通過PCR擴增、酶切、連接與轉(zhuǎn)化將編碼rTMP-GH的基因序列克隆至pMAL-p2x質(zhì)粒載體中，成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pMAL-rTMP-GH。陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21，經(jīng)0.1mol/L的IPTG于25℃誘導(dǎo)過夜，獲得高效、可溶性表達的MB

6、P-rTMP-GH融合蛋白(MBP-rTMP-GH占菌體總蛋白的55％以上)，采用疏水和陰離子柱層析獲得純化的融合蛋白MBP-rTMP-GH，經(jīng)Xa因子酶切去除MBP，再通過分子篩層析獲得純化的rTMP-GH(蛋白純度達95％以上)。 2.SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示純化所得的目的蛋白大小為24KD，與rTMP-GH的理論值一致；Westernblot結(jié)果表明該目的蛋白可以與人GH抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，進一步證實純化所得蛋白為r

7、TMP-GH。 3.體外細胞粘附實驗結(jié)果表明，rTMP-GH融合蛋白與巨核細胞有很強的結(jié)合能力，提示融合蛋白中的TMP可以發(fā)揮特異性結(jié)合巨核細胞的作用；巨核細胞集落分析和MTT檢測發(fā)現(xiàn)，rTMP-GH融合蛋白能顯著促進巨核細胞的增殖，其效果明顯優(yōu)于單純hGH和TMP處理組。 4.Westernblot和RT-PCR實驗結(jié)果表明，rTMP-GH能夠顯著上調(diào)體外培養(yǎng)巨核細胞中血小板生成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GATA-1的表達，進一

8、步提示rTMP-GH具有促進巨核細胞增殖與分化和生成血小板的作用。 5.體內(nèi)動物實驗結(jié)果表明：5Gyγ射線全身一次性照射可引起B(yǎng)alb/c小鼠外周血血小板顯著減少，并于第16天左右時達最低值(＜50,000/μl)。皮下注射400μg/kg的rTMP-GH融合蛋白，隔日一次，可顯著提高受照小鼠外周血血小板數(shù)目，其效果明顯優(yōu)于rhGH治療組和rhIL-11治療組。骨髓切片結(jié)果顯示，在照后第16天時空白對照組小鼠骨髓組織出血明顯，

9、有核細胞數(shù)顯著減少，巨核細胞尤為少見，骨髓出現(xiàn)空虛現(xiàn)象；而rTMP-GH處理組骨髓造血組織豐富，造血重建明顯，骨髓組織中有核細胞數(shù)量減少不明顯，僅有少部分空虛現(xiàn)象，并可見到不同時期的巨核細胞。提示體內(nèi)應(yīng)用。rTMP-GH融合蛋白具有顯著促進血小板生成的作用。 總之，本研究通過基因工程方法成功實現(xiàn)了rTMP-GH重組融合蛋白在大腸桿菌中的高效、可溶性表達與純化制備，體內(nèi)、外實驗結(jié)果均表明該融合蛋白具有顯著促巨核細胞增殖和血小板生