氧化應(yīng)激在HVJ-E致B16F10細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制.pdf

1、黑色素瘤是人類常見的惡性腫瘤之一，其具有惡性程度高、死亡率高、易轉(zhuǎn)移、發(fā)展迅速及預(yù)后差等特點(diǎn)。近幾年來，其發(fā)病率和死亡率一直呈現(xiàn)上升趨勢，但常規(guī)的治療方法已不能取得理想的效果。研究表明，滅活仙臺(tái)病毒(Hemaglutinating virus of JapanEnvelope，HVJ-E)可以誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。本文以小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16F10)為對象，研究活性氧(reactive oxygen specie

2、s，ROS)在HVJ-E致B16F10細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，為揭示仙臺(tái)病毒的抗腫瘤機(jī)制提供新的借鑒。
　　首先，我們用不同濃度的HVJ-E處理B16F10細(xì)胞，通過FACS（探針DCFH-DA）檢測細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生水平、倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、CCK-8法測定細(xì)胞活力、FACS(Annexin V/PI雙染法)檢測細(xì)胞凋亡、Hoechst33258熒光染色法觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。結(jié)果顯示，HVJ-E能夠引起B(yǎng)16F10細(xì)胞中ROS

3、水平的增加，同時(shí)HVJ-E能引起B(yǎng)16F10細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及核形態(tài)發(fā)生變化、細(xì)胞活力下降、凋亡率上升，并且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。提示ROS可能參與了HVJ-E致B16F10細(xì)胞凋亡的過程。
　　然后，我們用不同濃度的HVJ-E處理B16F10細(xì)胞，通過Western blotting方法檢測B16F10細(xì)胞中p53、Caspase、MAPK信號通路中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，隨著病毒濃度的增加，p53、Bax、Cleaved Cas

4、pase-3、PARP蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸減弱;MAPK信號通路中JNK、Erk1/2、p38蛋白磷酸化水平均逐漸增強(qiáng)。由此可以說明，p53、Caspase、MAPK信號通路可能參與了HVJ-E引起的B16F10細(xì)胞凋亡。
　　我們以活性氧清除劑(NAC)來分析ROS在HVJ-E致B16F10細(xì)胞凋亡中的作用。以NAC預(yù)處理B16F10細(xì)胞30 min后，加入HVJ-E作用24 h。再經(jīng)CCK-8法檢測細(xì)胞活力

5、、FACS檢測細(xì)胞凋亡率以及活性氧的產(chǎn)生水平、Western blotting方法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，NAC預(yù)處理能夠抑制HVJ-E引起的細(xì)胞活力的下降、能夠抑制HVJ-E致B16F10細(xì)胞凋亡率、能夠抑制細(xì)胞活性氧水平的增加;同時(shí)，NAC預(yù)處理也能夠抑制HVJ-E引起的細(xì)胞中p53、Bax、Cleaved Caspase-3、PARP蛋白表達(dá)的增加以及Bcl-2蛋白表達(dá)的下降;MAPK信號通路中，JNK、Erk1/2、p

6、38蛋白在NAC預(yù)處理后磷酸化水平也有所下降。這些均說明，ROS的確參與了HVJ-E致B16F10細(xì)胞凋亡的過程，且應(yīng)該是在信號通路的上游發(fā)揮調(diào)控作用。
　　最后，我們通過建立小鼠黑色素瘤模型來分析HVJ-E的溶瘤效應(yīng)及ROS的作用。BALB/c小鼠接種腫瘤細(xì)胞至直徑約為0.5 cm時(shí)，瘤內(nèi)分別注射PBS、HVJ-E、NAC和NAC+HVJ-E，每隔兩天測量一次腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，結(jié)果表明，與PBS組相比，HVJ-E組的腫

7、瘤體積生長緩慢，而NAC+HVJ-E組與HVJ-E組相比生長較快，說明NAC能夠抑制HVJ-E引起的腫瘤體積生長速度的下降。提取腫瘤組織蛋白并通過Westernblotting方法檢測，結(jié)果表明，NAC能夠抑制HVJ-E引起的小鼠黑色素瘤中p53、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的增加以及Bcl-2蛋白表達(dá)的下降;同時(shí)在MAPK信號通路中，JNK、Erk1/2、p38蛋白的磷酸化水平也有所下降。這些能夠說明，體內(nèi)方面與