Sry基因沉默對小鼠胚胎性別決定基因及性腺發(fā)育的影響.pdf

1、SRY(sex-determiningregionoftheYchromosome，鼠上稱Sry)是Y染色體上的性別決定基因，是激發(fā)哺乳動物兩性潛能的性腺向雄性分化的開關基因。雄性性別分化的過程是以SRY基因為主導的一系列上游基因和下游基因參與的級聯(lián)反應過程。由于SRY基因的體內(nèi)研究難于操作致使SRY基因的調控網(wǎng)絡研究進展緩慢，至今為止。SRY的下游作用靶基因還沒有鑒定出來。為進一步研究SRY基因功能，本研究采用siRNA表達載體介導的

2、RNAi技術，特異性地抑制睪丸決定因子Sry在小鼠胚胎中的表達。觀察Sry基因沉默后對在兩性性腺分化中起重要作用的WT1(Wilms’tumorgene)、Sox9(Sry-relatedHMGbox-9)，SF1(Steroidogenicfator-1)，GATA4(GATAbindingprotein4)、AMH(AntiMullerianHormone)和DAX1(Dosagesensitivesexreversallocus-

3、1)基因表達的影響，以及對小鼠胚胎性腺組織發(fā)育的影響。進一步揭示了Sry基因的調控機制，并為研究附植后小鼠胚胎發(fā)育基因提供了新思路。主要研究內(nèi)容和結論如下： 1)Sry小干擾RNA表達載體的重構，及其在胚胎中的表達鑒定。在本課題組先前構建的siRNA重組表達載體(pSilencer4.1/Sry565)和對照載體(pSilencer4.1-CMVneo)上分別插入EGFP表達框，即重構為含有綠色熒光蛋白的Sry干擾載體pSil

4、encer4.1/Sry565-EGFP(簡稱為pSry565-EGFP)和對照載體pSilencer4.1-CMVEGFPvector(簡稱為pControl-EGFP)。應用尾靜脈注射法將siRNA表達載體和對照載體分別導入妊娠9.5天(9.5dpc)的母鼠體內(nèi)，在11.5dpe時取胚胎，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白在小鼠胚胎中全身表達。證明，應用尾靜脈大量注射法可以將干擾質粒通過孕鼠導入小鼠胚胎，且干擾質粒在胚胎中廣泛表達無明

5、顯組織特異性。 2)siRNA表達載體對Sty基因抑制效果檢測。在11.5dpc時取胚胎，對胚胎進行性別鑒定。性別鑒定為雄性的胚胎以RT-PCR法檢測SrymRNA的表達抑制效果，用Western-blot檢測SRY蛋白表達抑制效果。結果表明，pSry565-EGFP的抑制效果顯著，Sty基因的mRNA和蛋白表達水平均降低，對StymRNA和SRY蛋白的抑制率可達80％。 3)Sry基因抑制對WT1，SF1，DAX1

6、，GATA4，Sox9及AMH基因表達的影響。用RT-PCR法檢測WT1等上述性別決定相關基因表達變化情況。結果表明，Sry基因沉默后，WT1基因表達量升高；而被認為最有可能是Sry下游基因的Sox9基因的表達沒有明顯變化；GATA4，SF1，DAX1基因表達水平也沒有顯著變化；在Sty基因表達抑制的小鼠胚胎和陰性對照的胚胎中均未檢測到AMH基因表達。結論，Sry基因表達抑制會導致WT1基因表達升高；另外，Sry基因激活Sox9基因的表