壬基酚與苯并芘對(duì)河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）雌激素受體影響的研究.pdf

1、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)是存在于環(huán)境中的一些人工合成的化學(xué)物質(zhì)。通過(guò)環(huán)境介質(zhì)和食物鏈進(jìn)入人體或生物體內(nèi)，干擾其內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖功能，影響后代的生存和繁衍。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物種類繁多，作用機(jī)制復(fù)雜，如類雌激素和類抗雌激素的拮抗效應(yīng)、類雌激素間的協(xié)同效應(yīng)等。為此，關(guān)于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的作用機(jī)理以及對(duì)其的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)已成為生態(tài)毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)。本文以河川沙塘鱧為研究載體，利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-tim

2、e PCR)的方法研究環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對(duì)魚類雌激素效應(yīng)的作用機(jī)制，并使之應(yīng)用于太湖流域水環(huán)境的環(huán)境雌激素的監(jiān)測(cè)當(dāng)中。 本實(shí)驗(yàn)從抽提河川沙塘鱧肝臟mRNA入手，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計(jì)合適的擴(kuò)增引物并優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件，最后得到河川沙塘鱧的卵黃蛋白原(Vtg)、雌激素受體α(ERα)、雌激素受體β(ERβ)基因的cDNA片段。測(cè)序并將其上傳至www.ncbi.nlm.nih.gov進(jìn)行BLAST。結(jié)果顯示經(jīng)本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增得到的Vtg

3、cDNA序列與矛尾刺鰕虎魚的有70％同源性，ERα cDNA序列與食蚊魚的有100％同源性，ERβ cDNA序列與尼羅羅非魚的有86％同源性。隨后通過(guò)半定量PCR實(shí)驗(yàn)初步確定了這三種基因在雌魚肝臟、卵巢和雄魚肝臟中的相對(duì)表達(dá)量。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究Vtg、ERβ、ERβ基因奠定了分子生物學(xué)的基礎(chǔ)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)獲得的的三段cDNA片段分別設(shè)計(jì)Real-time PCR引物。并對(duì)河川沙塘鱧進(jìn)行腹腔注射NP(NP)和BaP(BaP)暴露實(shí)驗(yàn)。

4、對(duì)注射200mg/kg NP的雄性河川沙塘鱧在第1、2、4、7、10、14天分別取樣；對(duì)注射20mg/kg BaP的雌性河川沙塘鱧也在第1、2、4、7、10、14天分別取樣。此外，用50、100、200mg/kg的NP對(duì)雄性河川沙塘鱧注射暴露，6天后取樣；用2、10、20mg/kg的BaP對(duì)雌性塘鱧注射暴露，6天后取樣。將上述所有樣品分別進(jìn)行檢測(cè)，其中肝臟樣品用于Vtg、ERα、ERβ基因的RT real-time PCR定量實(shí)驗(yàn)；血清

5、樣品則應(yīng)用ELISA實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)Vtg蛋白的表達(dá)量。 結(jié)果顯示：在NP的時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，隨著注射暴露實(shí)驗(yàn)的開(kāi)始，雄性河川沙塘鱧的ERα、ERβ和Vtg mRNA都有一個(gè)先升后降的過(guò)程，并且ERα、ERβmRNA上升和下降的趨勢(shì)先于Vtg。說(shuō)明NP對(duì)于ERα、ERβ和Vtg mRNA都有誘導(dǎo)作用，且ERα、ERβ和Vtg之間可能存在調(diào)控與被調(diào)控的關(guān)系。NP的濃度效應(yīng)實(shí)驗(yàn)體現(xiàn)了NP濃度越高，誘導(dǎo)作用越強(qiáng)的特點(diǎn)。BaP作為芳香烴受體的

6、激動(dòng)劑，其時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與NP類似，但上調(diào)和下降的時(shí)間提早，20mg/kg BaP對(duì)雌性河川沙塘鱧有誘導(dǎo)的作用。BaP的濃度效應(yīng)實(shí)驗(yàn)與時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)，低濃度和中濃度BaP對(duì)ERα、ERβ、Vtg基因以及Vtg蛋白具有抑制作用，高濃度20mg/kg時(shí)表現(xiàn)出促進(jìn)作用。將上述ELISA檢測(cè)方法應(yīng)用于太湖水域環(huán)境雌激素的監(jiān)測(cè)。分別在冬季四個(gè)地點(diǎn)、春季六個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行采樣。結(jié)果顯示，河川沙塘鱧春季血清Vtg蛋白的含量要明顯高于冬季。雄性河川沙塘鱧