擬南芥AT14A蛋白的細(xì)胞學(xué)定位及在介導(dǎo)細(xì)胞壁-質(zhì)膜-細(xì)胞骨架連續(xù)體中的功能研究.pdf

1、植物細(xì)胞壁-質(zhì)膜-細(xì)胞骨架連續(xù)體的研究目前還處于起步階段，特別是質(zhì)膜上的聯(lián)結(jié)分子特性與功能還未形成定論。在動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜上存在一類整合素蛋白(integrin)，它是一類胞外基質(zhì)受體，介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附作用和細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞分化、細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用、細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境應(yīng)答等。在植物細(xì)胞中是否也存在類似于動(dòng)物細(xì)胞中的整合素蛋白分子目前尚無直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。AT14A蛋白氨基酸序列中有一段與動(dòng)物整合素蛋白同源，

2、然而，目前還不清楚該蛋白是否就是植物細(xì)胞中的整合素蛋白(稱為類整合素，integrin-like proteins)?如是，其功能又是如何?針對(duì)上述科學(xué)問題，本研究首先從擬南芥基因組中克隆了編碼AT14A的基因序列，構(gòu)建了相應(yīng)突變體和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系，最后研究了該蛋白在介導(dǎo)細(xì)胞壁-質(zhì)膜-細(xì)胞骨架連續(xù)體中的功能。取得的主要結(jié)果如下： 1、采用RT-PCR和TOPO克隆的方法從擬南芥中克隆出了AT14A，并與含GFP報(bào)告基

3、因的表達(dá)載體連接，得到AT14A-GFP融合基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化野生型植株及懸浮細(xì)胞，獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株和懸浮細(xì)胞體系。通過觀察GFP的熒光，確定AT14A在組織和細(xì)胞水平的定位。同時(shí)，完整植物材料體系的建立為研究AT14A的功能奠定了基礎(chǔ)。 2、利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，以GFP抗體作為探針，在過表達(dá)轉(zhuǎn)AT14A-GFP融合基因的懸浮細(xì)胞總蛋白與膜蛋白中均檢測(cè)到了AT14A-GFP融合蛋白的存在，其分子量在70 k

4、Da左右。且通過免疫印跡方法，在膜蛋白中也檢測(cè)到了AT14A-GFP融合蛋白的存在，證實(shí)AT14A定位在質(zhì)膜上。 3、通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)缺失型突變體at14a懸浮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯變化，即60％以上變成球形。利用熒光定位技術(shù)，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)野生型、缺失型突變體at14a、過表達(dá)轉(zhuǎn)AT14A-GFP融合基因懸浮細(xì)胞的細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)與排列存在差異：缺失型突變體at14a懸浮細(xì)胞的微絲束變粗，且排列變

5、得稀疏，而過表達(dá)轉(zhuǎn)AT14A-GFP融合基因的懸浮細(xì)胞的微絲排列較野生型密集；缺失型突變體at14a細(xì)胞的微管排列雜亂而無規(guī)則，但過表達(dá)轉(zhuǎn)AT14A-GFP融合基因細(xì)胞的微管形態(tài)與排列與野生型無明顯區(qū)別。 4、對(duì)懸浮細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)大小的觀察及統(tǒng)計(jì)的結(jié)果表明，野生型懸浮細(xì)胞57％的細(xì)胞團(tuán)包含2-10個(gè)細(xì)胞，40％的細(xì)胞團(tuán)包含10個(gè)以上細(xì)胞；缺失型突變體at14a懸浮細(xì)胞42％以單個(gè)游離的形式存在，且低于10％的細(xì)胞團(tuán)包含10個(gè)以上細(xì)

6、胞；而過表達(dá)轉(zhuǎn)AT14A-GFP融合基因懸浮細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)有74％包含10個(gè)以上細(xì)胞。此結(jié)果說明，AT14A參與了細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附。對(duì)三種基因型的懸浮細(xì)胞進(jìn)行滲透脅迫處理的結(jié)果表明野生型細(xì)胞有90％以上發(fā)生部分質(zhì)壁分離，約6％發(fā)生完全分離；而缺失型突變體at14a細(xì)胞均發(fā)生了質(zhì)壁分離，并且其中62％發(fā)生了完全質(zhì)壁分離；過表達(dá)轉(zhuǎn)AT14A-GFP融合基因懸浮細(xì)胞的分離情況與野生型無明顯差異。通過測(cè)定三種基因型植株離體葉片失水速率的測(cè)定結(jié)

7、果表明缺失型突變體at14a離體葉片的失水速率最大，野生型次之，過表達(dá)植株的離體葉片的失水速率最小。以上結(jié)果提示：AT14A作為細(xì)胞壁(CW)-質(zhì)膜(PM)-細(xì)胞骨架(CTK)連續(xù)體的重要聯(lián)結(jié)分子，由于AT14A的缺失，導(dǎo)致細(xì)胞壁與質(zhì)膜的粘附性降低，所以，在同樣的脅迫條件下，缺失型突變體at14a懸浮細(xì)胞完全質(zhì)壁分離的情況最為明顯。并且，AT14A參與了細(xì)胞對(duì)滲透脅迫的響應(yīng)過程，缺失型突變體由于AT14A功能的缺失，因而失去了對(duì)于滲透脅