蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮治療類風濕關節(jié)炎的實驗研究.pdf

1、引言
　　類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid Arthrits，RA)是主要累及小關節(jié)的滑膜慢性炎癥，屬于自身免疫性疾病范疇，常常會引起關節(jié)腫痛、軟骨破壞、關節(jié)間隙變窄、關節(jié)畸形等改變，若得不到及時和正確的診治會造成人體不同程度的殘疾[1]。該病屬于傳統(tǒng)醫(yī)學的痹癥范疇，常見癥型有4種:風寒濕痹、風濕熱痹、痰瘀痹阻、肝腎陰虛等。RA患者骨與關節(jié)的早期病理變化是骨質(zhì)疏松(Osteoporosis，Op)，有研究指出RA患者普遍存在骨量

2、流失的現(xiàn)象。Wnt信號通路在炎癥與骨代謝方面發(fā)揮重要作用，主要通過Wnt家族蛋白或信號通路上相關蛋白通過自分泌或旁分泌的方式與細胞膜上相應受體結(jié)合，激活細胞質(zhì)中的對應信號分子，從而促進下游基因轉(zhuǎn)錄。蜂毒素（Melittin），是蜂毒中具有藥物作用的主要活性物質(zhì)，具有抗炎、抗菌與鎮(zhèn)痛藥用價值。有研究表明蜂毒素能夠有效抑制多種病原微生物生長。蜂針、蜂療已有千年歷史，尤其是在治療關節(jié)炎等炎性疼痛方面，療效顯著。但蜂毒素存在易溶血和易過敏的不良

3、反應，限制其應用范圍。杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)為落葉喬木，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載杜仲“主治腰膝痛，補中，益精氣，堅筋骨，除陰下癢濕，小便余瀝。久服，輕身耐老”的作用。杜仲是中國特有藥材，廣泛應用于臨床，其性甘，溫。歸肝、腎經(jīng)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn):杜仲對中樞神經(jīng)、循環(huán)、免疫、內(nèi)分泌、泌尿系統(tǒng)均存在不同程度的調(diào)節(jié)作用。有大量研究表明杜仲提取物在體外有較顯著的抗氧化溶血而保護紅細胞的作用。杜仲黃酮是杜仲的有效提取物。

4、蜂毒素具有易溶血的不良反應，而杜仲具有明顯的抗溶血作用，故將二者聯(lián)合使用觀察杜仲能否減輕蜂毒素的溶血作用，進而增加抗炎作用。
　　本文從細胞、分子、動物層面探究蜂毒素、杜仲黃酮單用及聯(lián)合給藥的最佳藥物濃度及治療效果。研究發(fā)現(xiàn)CIA模型小鼠關節(jié)會出現(xiàn)骨量不均的現(xiàn)象，與人類RA的早期病理改變——骨質(zhì)疏松相似，中醫(yī)強調(diào)關節(jié)乃骨之連接，筋脈聚集之所，肝主筋、腎主骨，本文在動物實驗的基礎上進行了肝腎陰虛型類風濕關節(jié)炎臨床發(fā)病情況及與骨質(zhì)疏松

5、的關聯(lián)的探討。
　　本論文共分為三部分研究內(nèi)容。
　　第一部分蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮通過WNT信號通路抑制類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞生長機制的研究
　　目的:
　　探究蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路上Wnt-1，Dkk-1，C-myc，β-catenin蛋白抑制類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞的生長機制。
　　方法:
　　選擇類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞(RA-FLS)培養(yǎng)至3-7代，流式細胞術檢測細胞

6、表面標記抗體，驗汪為RA-FLS細胞。待細胞增殖至適當數(shù)目后接種于六孔板中，除空白對照外其余各孔加入10ng/mL TNF-α誘導RA-FLS細胞成為異常增殖的類風濕關節(jié)炎細胞模型。用不同濃度的蜂毒素、杜仲黃酮、蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮混合制劑處理RA-FLS細胞模型，MTT法檢測細胞增殖情況。Western Blot檢測不同處理組Wnt-1、β-catenin、C-myc及DKK-1蛋白的表達情況。所有實驗結(jié)果運用SPSS19.0進行整理與

7、分析。
　　結(jié)果:
　　濃度為1、10、100、1000ng/μL的蜂毒素、杜仲黃酮無論是單獨還是聯(lián)合使用均可以有效地減低RA-FLS的生存率。其中藥物濃度為1000ng/μL蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮對細胞抑制率最高，達到89.73％。用藥后Wnt-1、β-catenin、C-myc、DKK-1蛋白的表達量均較TNF-A誘導的RA-FLS模型組明顯降低，蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮組的蛋白含量最低。(p＜0.05)
　　結(jié)論:

8、　　蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮能夠有效抑制被TNF-α誘導刺激異常增殖的RA-FLS的生長，藥物濃度為1000ng/μL效果最好，作用機制可能是通過抑制Wmt信號通路Wnt1、β-catenin、C-myc、DKK-1蛋白的表達。
　　第二部分外用蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮治療膠原誘導型關節(jié)炎小鼠模型
　　目的:
　　觀察外用蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮治療膠原誘導型關節(jié)炎小鼠模型的效果。
　　方法:
　　將昆明小鼠分為空白對照組與

9、造模組，造模組按照膠原誘導型(CIA)小鼠造模方法制備成關節(jié)炎小鼠，分為PBS組、蜂毒素組、杜仲黃酮組及混合給藥組。按分組不同，每組給予不同的藥物（藥物濃度均為1μg/μL）外涂。每只足爪給予5μL藥物，共給藥15天，PBS對照組給予等量的PBS。每日測量小鼠的足墊厚度及踝關節(jié)的寬度;給藥前后均進行足爪部位X線檢查;待給藥結(jié)束后處死小鼠，ELISA法檢測相關因子(TNF-α、IL-1β、IL-2、GM-CSF);計算關節(jié)腫脹度及脾指數(shù)。

10、實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計處理。
　　結(jié)果:
　　肉眼觀察可見，蜂毒素、杜仲黃酮及混合給藥組的小鼠足爪的腫脹程度均輕于造模PBS組;通過足墊厚度、足踝寬度及足爪腫脹度測量比較后發(fā)現(xiàn)，給藥組小鼠的關節(jié)腫脹情況均得到緩解，其中混合給藥組小鼠的關節(jié)改善情況優(yōu)于其他組(p＜0.05);ELISA檢測小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-2、GM-CSF等炎癥因子發(fā)現(xiàn)，混合給藥組小鼠各項免疫學指標改變優(yōu)于其他組(p＜0.05)

11、。
　　結(jié)論:
　　外涂蜂毒素、杜仲黃酮、蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮均可以有效改善CIA小鼠的關節(jié)腫脹情況，其中混合給藥組效果最好，具體的作用機制可能是抑制相關炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-2、GM-CSF）的表達。
　　第三部分:肝腎陰虛型類風濕關節(jié)炎與骨質(zhì)疏松相關性臨床研究
　　目的:
　　探究肝腎陰虛型RA患者伴發(fā)骨質(zhì)疏松的發(fā)生情況，并從類風濕關節(jié)炎相關指標、急性炎癥指標、骨代謝指標、骨密度結(jié)果分析

12、其相關性。
　　方法:
　　選擇2015年10月～2016年5月來自上海光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院關節(jié)內(nèi)科的類風濕關節(jié)炎住院病人。參與研究的患者應排除相關禁忌，參與本研究前未進行過正規(guī)抗骨質(zhì)疏松治療，且女性均為絕經(jīng)后患者，男性年紀均超過50歲。完成相關調(diào)查表的填寫，主要對其血常規(guī)、急性炎癥指標(血沉ESR，C-反應蛋白CRP)、類風濕因子(IgM RF、IgARF、IgGRF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP抗體）、骨代謝指標(骨鈣素O

13、T;I型膠原交聯(lián)C末端肽CTX;I型膠原N端前肽PINP;甲狀旁腺激素PTH;1，25(OH)2D3)檢測數(shù)值、腰椎和左髖部進行常規(guī)骨密度(BMD)數(shù)值的填寫。所有實驗結(jié)果運用SPSS19.0進行整理與分析。
　　結(jié)果:
　　共64名RA患者參與研究，其中30人同時伴發(fā)骨質(zhì)疏松(46.88％)?；颊叩难t蛋白值在骨量正常與骨量減少、骨量正常與骨質(zhì)疏松組間存在統(tǒng)計學差異，骨量正常組的血紅蛋白數(shù)值較高。抗CCP抗體、IgMRF與

14、髖部BMD水平呈明顯的負相關關系。年齡、抗CCP抗體滴度、ESR情況均為是否發(fā)生伴發(fā)骨質(zhì)疏松的危險因素。年齡大于65歲患者較其他患者骨質(zhì)疏松的風險多一倍;高滴度抗CCP抗體患者腰椎OP的發(fā)生情況比其他患者高13倍;高滴度抗CCP抗體患者髖部OP的發(fā)生情況其他患者的4倍余;血沉異?；颊叩难导绑y部OP的發(fā)生情況均較其他患者多9倍。
　　結(jié)論:
　　年齡大于65歲，抗CCP抗體和ESR水平較高、血紅蛋白水平較低的肝腎陰虛型RA患