RNA干擾沉默TCF8對高糖和血管緊張素Ⅱ致足細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)換的研究.pdf

1、在腎臟，足細(xì)胞附著在腎小球基底膜外，其足突上多種分子相互交錯(cuò)形成裂孔隔膜（slit diaphragm，SD），是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分。足細(xì)胞在保護(hù)腎小球?yàn)V過屏障的完整性方面起著重要的作用。足細(xì)胞的功能與腎臟功能密切相關(guān)，其超微結(jié)構(gòu)的變化或與功能相關(guān)的分子表達(dá)改變均與腎臟功能的損害有著密切的關(guān)系。一般來說，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是極化上皮細(xì)胞發(fā)生許多生化變化，

2、以獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型。足細(xì)胞是上皮細(xì)胞，當(dāng)受到不同的刺激（如TGF-β，高濃度的葡萄糖，血管緊張素Ⅱ，阿霉素等）時(shí)，有可發(fā)生EMT。當(dāng)EMT的發(fā)生，上皮表型標(biāo)志物如E-cadherin，P-cadherin，nephrin、podocalyxin，Synaptopodin的下調(diào)，與間質(zhì)表型標(biāo)志物如desmin，F(xiàn)SP-1，MMP-9，ILK，fibronectin，vimentin，α-SMA，Ⅰ型膠原及snai等上調(diào)。在受損的腎臟產(chǎn)生

3、腎間質(zhì)纖維化中，EMT被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵因素。足細(xì)胞EMT可引起腎小球?yàn)V過屏障的損傷和蛋白尿，嚴(yán)重者可導(dǎo)致足細(xì)胞由腎小球基底膜脫離和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量減少，從而加重蛋白尿和腎臟功能損傷甚至腎小球硬化。足細(xì)胞EMT是研究蛋白尿和腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要方面。研究目的:探討在高濃度的葡萄糖和血管緊張素Ⅱ存在下，足細(xì)胞的EMT以及TCF8在足細(xì)胞EMT中的影響。
　　方法:足細(xì)胞經(jīng)分化后，經(jīng)與血管緊張素Ⅱ和葡萄糖分別孵育，Wes

4、tern blotting方法檢測蛋白表達(dá);Transwell小室檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力。qPCR方法檢測mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.血管緊張素Ⅱ和高糖對正常足細(xì)胞E-cadherin、α-catenin、N-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)的影響
　　血管緊張素Ⅱ和葡萄糖可使足細(xì)胞上皮標(biāo)志分子E-cadherin和α-catenin蛋白的表達(dá)逐漸降低，而足細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志分子N-cadherin和Vi

5、mentin表達(dá)均升高。
　　2.血管緊張素Ⅱ和高糖對正常足細(xì)胞TCF8蛋白表達(dá)的影響
　　足細(xì)胞經(jīng)葡萄糖或血管緊張素Ⅱ孵育后，隨著葡萄糖或血管緊張素Ⅱ濃度的增加，TCF8蛋白的表達(dá)逐漸升高。
　　3.血管緊張素Ⅱ和高糖對正常足細(xì)胞遷移和侵襲能力
　　足細(xì)胞經(jīng)葡萄糖或血管緊張素Ⅱ作用后，其遷移和侵襲能力有明顯增加。
　　4.TCF8 siRNA篩選
　　足細(xì)胞經(jīng)TCF8基因沉默后，TCF8的表達(dá)明顯降

6、低，其中1＃siRNA的作用最強(qiáng)。
　　5.沉默TCF8基因?qū)-cadherin、α-catenin、N-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)的影響
　　未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上皮標(biāo)志物分子E-cadherin和α-catenin均有表達(dá)，而間質(zhì)標(biāo)志物分子N-cadherin和vimentin較低。經(jīng)高糖或血管緊張素Ⅱ刺激后，E-cadherin和α-catenin表達(dá)降低，N-cadherin和vimentin表達(dá)增加。s

7、hTCF8＃1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，高濃度葡萄糖和血管緊張素Ⅱ均可使上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和α-catenin表達(dá)增加，間質(zhì)標(biāo)志物分子N-cadherin和vimentin表達(dá)降低，表明TCF8表達(dá)沉默后，細(xì)胞不利于間質(zhì)轉(zhuǎn)換，提示TCF8具有促進(jìn)EMT作用。
　　6.沉默TCF8基因?qū)ψ慵?xì)胞遷移和侵襲能力
　　未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)高糖或血管緊張素Ⅱ刺激后，細(xì)胞遷移和侵襲能力增加，TCF8基因沉默后，細(xì)胞遷移和侵襲能力降低。表明