血管緊張素Ⅱ?qū)ψ甜B(yǎng)細(xì)胞侵襲力影響的研究.pdf

1、背景與目的: 子癇前期(preeclampsia)是妊娠期特有的疾病，是孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的主要原因之一。目前病因不明，給該病的防治工作帶來(lái)困難。研究表明血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)及其1型受體(Angiotensinreceptor1subtype，AT1R)的異常表達(dá)，在子癇前期(pre-eclampsia)發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[1]。母兒界面AngⅡ水平升高或與其受體結(jié)合增強(qiáng)，影響了正常胎盤的形成

2、和螺旋動(dòng)脈的重鑄，參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展。纈沙坦是AT1R高度特異拮抗劑，能阻斷AngⅡ和AT1R結(jié)合，具有高效的抗高血壓作用，其能否用于子癇前期的防治未見(jiàn)報(bào)道。 滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力下降是子癇前期發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。有研究[3]發(fā)現(xiàn)100nMAngⅡ作用滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/Svneo24小時(shí)能顯著抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力，但諸多的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AngⅡ通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)局灶粘附激酶(focaladhesionkinase,FAK)酪氨

3、酸磷酸化，促進(jìn)多種細(xì)胞如血管平滑肌、內(nèi)皮細(xì)胞等增殖、遷移/侵襲[4，5]。FAK是介導(dǎo)細(xì)胞侵襲/遷移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要激酶之一，其中FAK的酪氨酸397位點(diǎn)(tyr397)是細(xì)胞遷移的關(guān)鍵部位[6]，在子癇前期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(cytotrophoblast,CTB)中FAK(tyr397)低表達(dá)[7]。AngⅡ能否通過(guò)FAK信號(hào)通路調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)活性尚未見(jiàn)研究報(bào)道。 我們利用寒冷刺激子癇前期孕鼠模型[8]，研究纈沙坦對(duì)子癇前

4、期的防治作用，以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子FAK(tyr397)在子癇前期及纈沙坦治療孕鼠胎盤組織中的表達(dá)；體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞，研究AngⅡ及其受體AT1對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的影響及FAK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)AngⅡ在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力中的作用。有望通過(guò)本實(shí)驗(yàn)?zāi)軐?duì)子癇前期的發(fā)病機(jī)制的研究及防治提供一定的幫助。 方法: 第一部分：血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦對(duì)寒冷刺激子癇前期孕鼠防治作用。建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)分三組：正常妊娠組(N組)；寒冷刺激誘發(fā)子癇

5、前期組(H組)；纈沙坦干預(yù)治療組(V組)。V組孕鼠纈沙坦水溶液灌胃(10mg/kg·d)，N和H組孕鼠蒸餾水灌胃，定期測(cè)鼠尾動(dòng)脈收縮壓及15h尿蛋白。于妊娠第19天剖腹取胎，計(jì)數(shù)胎鼠存活率及體重，留取腎、胎盤組織，HE染色觀察組織形態(tài)病理學(xué)變化，免疫組化法檢測(cè)胎盤組織中FAK(tyr397)的表達(dá)。 第二部分：血管緊張素Ⅱ?qū)ψ甜B(yǎng)細(xì)胞侵襲力的影響及機(jī)制初步研究。采用組織貼塊法、Ficoll分離及差速貼壁法對(duì)早孕絨毛純化培養(yǎng)，細(xì)胞角

6、蛋白7(Cytokeratin7,CK-7)及vimentin免疫鑒定。不同濃度AngⅡ及纈沙坦處理滋養(yǎng)細(xì)胞，用被覆Matrigel膜的體外侵襲模型transwell分析AngⅡ及其受體AT1影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的量效及時(shí)效關(guān)系。并用Westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)FAK(tyr397)磷酸化水平。 結(jié)果: 第一部分：妊娠第6天以后V組的血壓顯著低于H組(P＜0.01)，第12后發(fā)現(xiàn)V組的血壓同時(shí)顯著低于N組(P＜0.05

7、)。妊娠第18天時(shí)V組的尿蛋白顯著低于H組(P＜0.05)。三組胎鼠的體重及胎盤重量無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。V組胎鼠存活率只有85.53％，明顯低于N組(100％)和H組(98.18％)。V組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞FAK(tyr397)蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度顯著高于H組(P＜0.01)，胎盤、腎組織的異常病理狀況有明顯改善。 第二部分：不同濃度AngⅡ作用24h，當(dāng)AngⅡ濃度為10-6M時(shí)，遷移的細(xì)胞數(shù)最多，較對(duì)照組顯著升高(P＜0

8、.01)。之后隨濃度升高，細(xì)胞侵襲力下降，當(dāng)濃度達(dá)到10-5M時(shí)，遷移的細(xì)胞數(shù)顯著降低(P＜0.05)。10-5MAngⅡ作用不同時(shí)間點(diǎn)后發(fā)現(xiàn)12h時(shí)細(xì)胞侵襲能力最強(qiáng)，顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，之后迅速下降，24h、48h及72h細(xì)胞侵襲能力均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，而對(duì)照組細(xì)胞侵襲力先升高，到48h時(shí)侵襲力最強(qiáng)，之后降低。用纈沙坦預(yù)處理30min再用10-5MAngⅡ作用24h，細(xì)胞侵襲力較10-5MAngⅡ組升高(P＞

9、0.05)。不同濃度AngⅡ作用10min后測(cè)FAK(tyr397)磷酸化水平，隨AngⅡ濃度增加FAK(tyr397)水平升高，當(dāng)AngⅡ濃度為10-7M時(shí)，較對(duì)照組有顯著性升高(P＜0.01)，當(dāng)濃度為10-5M時(shí)FAK(tyr397)表達(dá)最高。10-5MAngⅡ作用不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)FAK(tyr397)磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)5min時(shí)顯著升高(P＜0.01)，10min時(shí)達(dá)高峰，之后逐漸下降，但20min、30min時(shí)FAK(tyr397)

10、磷酸化水平均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，60min時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。10-7M纈沙坦+10-5MAngⅡ共同處理細(xì)胞后，F(xiàn)AK活性較10-5MAngⅡ組明顯降低(P＜0.01)，較10-7M纈沙坦處理組顯著性升高(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.纈沙坦用于子癇前期孕鼠，能明顯改善子癇前期的臨床癥狀及病理改變，使子癇前期孕鼠血壓下降、蛋白尿減輕，腎、胎盤組織的病理改變減輕。 2.纈沙坦

11、干預(yù)治療后能明顯提高胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞FAK(tyr397)的表達(dá)，提示纈沙坦可能通過(guò)增強(qiáng)子癇前期孕鼠滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力從而控制子癇前期發(fā)生。 3.滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力與AngⅡ濃度及作用時(shí)間有關(guān)。AngⅡ短時(shí)間作用能增強(qiáng)細(xì)胞侵襲力；AngⅡ高濃度、長(zhǎng)時(shí)間作用時(shí)能抑制細(xì)胞侵襲力，纈沙坦能阻斷AngⅡ?qū)ψ甜B(yǎng)細(xì)胞侵襲力的影響。推測(cè)體內(nèi)過(guò)度升高的AngⅡ長(zhǎng)時(shí)間作用，能通過(guò)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生。 4.AngⅡ通過(guò)與受體AT1結(jié)合