拉布拉多犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與牙周膜基質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞裸鼠皮下成骨能力的比較性研究.pdf

1、目的:通過(guò)體外加入骨向誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)，觀察比較犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)和牙周膜基質(zhì)干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)的形態(tài)特征及兩者在體外成骨能力的差異；再分別與支架材料β-磷酸三鈣(β-TCP)復(fù)合并植入裸鼠皮下后，探索拉布拉多犬 BMSCs和拉布拉多犬PDLSCs異位成骨能力的差異。
　　方法:（1）犬BMSCs

2、的培養(yǎng)：成年拉布拉多犬一只，將犬髂后上棘去毛后消毒，鋪巾，待麻醉起效后，用骨髓穿刺針于犬髂后上棘穿刺抽取骨髓于離心管中，低速離心后將其接種于培養(yǎng)皿中，加入DMEM。待細(xì)胞培養(yǎng)至第3代后，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好者，加入成骨向分化誘導(dǎo)液進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)；（2）犬PDLSCs的培養(yǎng)取成年拉布拉多犬一只，消毒鋪巾麻醉起效后，拔取左下頜三顆下前牙，用PBS緩沖液從根尖向牙冠方向反復(fù)沖洗多次，用銳利手術(shù)刀片刮取牙根中部1/3的牙周膜組織，剪碎后接種于培養(yǎng)皿

3、中，添加適量DMEM，待細(xì)胞培養(yǎng)至第3代后，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好者，加入成骨向分化誘導(dǎo)液進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)。（3）檢測(cè)方法：MTT法檢測(cè)兩種基質(zhì)干細(xì)胞的增殖差異；骨向誘導(dǎo)后1d、4d、7d、14d及21d，采用堿性磷酸酶（ALP）染色法和茜素紅（ARS）染色法法檢測(cè)兩者成骨分化情況；骨向誘導(dǎo)后1d、4d、7d、14d及21d，RT-PCR檢測(cè)成骨誘導(dǎo)后成骨相關(guān)基因表達(dá)情況。取誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后的第三代拉布拉多犬 BMSCs和拉布拉多犬 PDLSCs

4、，分別與2mm×Φ6mmβ-TCP復(fù)合。實(shí)驗(yàn)分為3組，即β-TCP組,犬BMSCs/β-TCP復(fù)合體組,犬 PDLSCs/β-TCP復(fù)合體組。將細(xì)胞體外與材料復(fù)合后，常規(guī)培養(yǎng)3d，利用掃描電鏡觀察細(xì)胞與材料的黏附情況。并將各組復(fù)合物植入裸鼠皮下，裸鼠常規(guī)飼養(yǎng)8周后取材，通過(guò)HE染色觀察新骨形成情況，免疫組化檢測(cè)成骨相關(guān)基因蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:（1） BMSCs原代培養(yǎng)7d后，在顯微鏡下觀察可見(jiàn)有細(xì)胞爬出，并大量增殖，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭

5、狀；（2）PDLSCs原代培養(yǎng)7d后，顯微鏡下觀察可見(jiàn)有大量細(xì)胞從牙周膜組織塊中爬出，成放射狀分布，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀。兩者在細(xì)胞形態(tài)上無(wú)明顯差異；（3）MTT檢測(cè)顯示兩者均有良好的體外增殖能力，其中BMSCs的增殖能力稍強(qiáng)；（4）ALP和ARS的染色結(jié)果顯示兩者隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加均有陽(yáng)性顯色，且陽(yáng)性染色結(jié)果漸強(qiáng)，同一時(shí)間點(diǎn)BMSCs的染色比PDLSCs的深；（5）RT-PCR結(jié)果顯示，在成骨誘導(dǎo)的過(guò)程中，成骨誘導(dǎo)相關(guān)基因BMP2、OCN、 R

6、UNX2、HIF-1α、VEGF、CLOOAGEN-1等都有明顯的表達(dá)，與PDLSCs組相比，BMSC組BMP2基因在骨誘導(dǎo)1d表達(dá)顯著高于PDLSCs組（P<0.01）但在骨誘導(dǎo)的7d和14d PDLSCs組BMP2基因表達(dá)要高于BMSC組（P<0.01）。BMSCs組 OCN基因，基因在骨誘導(dǎo)14d時(shí)表達(dá)明顯強(qiáng)于PDLSCs組（P<0.01）。RUNX2兩組中都有高表達(dá)但是結(jié)果顯示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。BMSCs組HIF-1α，基因在骨誘導(dǎo)

7、4d時(shí)表達(dá)明顯低于PDLSCs組（P<0.01）。COLLAGEN-1 BMSCs組基因在骨誘導(dǎo)1d、4d、7d及14d時(shí)表達(dá)明顯高于PDLSCs組（P<0.01）。
　　掃描電鏡結(jié)果表明犬BMSCs和犬PDLSCs均可在β-TCP支架材料上正常生長(zhǎng)。兩種細(xì)胞均以較高的細(xì)胞密度生長(zhǎng)于β-TCP表面及孔隙中，與骨架材料結(jié)合較好。裸鼠皮下組織切片HE染色結(jié)果顯示，犬BMSCs和犬PDLSCs組都有新生骨樣組織形成，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示