CUEDC2啟動(dòng)子及其轉(zhuǎn)錄因子的研究和CUEDC2打靶載體的構(gòu)建.pdf

1、CUEDC2是一個(gè)功能尚不完全清楚的基因,位于人基因組10號(hào)染色體上,由9個(gè)外顯子組成,它包含CUE結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域是一個(gè)含約40個(gè)氨基酸殘基的保守結(jié)構(gòu),廣泛存在于真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)中,它能與泛素結(jié)合,既能識(shí)別單泛素也能識(shí)別多泛素,并能夠促進(jìn)分子內(nèi)的單泛素化,含有CUE結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中也發(fā)揮一定的作用。CUEDC2能夠和孕激素受體(PR)相互作用并抑制孕激素受體的活性,而且CUEDC2可以通過(guò)泛素蛋白酶體通路促進(jìn)孕激素

2、受體的降解,干涉CUEDC2后在孕激素刺激下孕激素受體降解減少;而孕激素受體在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有很重要的作用,提示CUEDC2可能對(duì)乳腺癌的進(jìn)程有一定的抑制作用(The EMBO Journal,2007)。進(jìn)一步的研究顯示,CUEDC2與IKK和蛋白磷酸酶1(PP1)存在同一復(fù)合體中,能夠通過(guò)招募PP1抑制IKK的磷酸化和激活,從而抑制NF-κB的激活,提示CUEDC2可能在炎性反應(yīng)過(guò)程中也有一定的作用(Nature Immun

3、ology,2008)。
　　由于CUEDC2可能有很重要的生物學(xué)功能,所以本項(xiàng)研究運(yùn)用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)了CUEDC2可能的啟動(dòng)子區(qū)域和可能參與調(diào)控它的轉(zhuǎn)錄因子。用PCR的方法對(duì)預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,獲得300bp、600bp、1000bp和2000bp的DNA序列,經(jīng)測(cè)序鑒定正確后將其與不含啟動(dòng)子的pEGFP1報(bào)告基因載體連接,轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,通過(guò)熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)4個(gè)不同長(zhǎng)度的DNA序列都能夠驅(qū)動(dòng)綠色熒光的表

4、達(dá),具有啟動(dòng)子活性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證克隆序列的啟動(dòng)子活性,我們把4個(gè)不同長(zhǎng)度的DNA序列和螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體pGL3-Basic連接,轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后通過(guò)熒光素酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)4個(gè)DNA序列都具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。我們選取一些轉(zhuǎn)錄因子和螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)NF-κB2/p52能夠很強(qiáng)的抑制CUEDC2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,并且在過(guò)表達(dá)p52的HEK293T細(xì)胞中,CUEDC2的mRNA量和內(nèi)源CUEDC2蛋白量都

5、減少,進(jìn)一步證實(shí)了p52是CUEDC2基因的轉(zhuǎn)錄抑制子。NF-κB1/p50也能抑制CUEDC2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,但抑制效果不如p52強(qiáng),NF-κB另外一個(gè)亞基 p65/RelA對(duì)CUEDC2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性沒(méi)有影響。其它的轉(zhuǎn)錄因子如HSF、C-jun和IRF3等對(duì)CUEDC2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性幾乎沒(méi)有影響。為了更準(zhǔn)確的定位啟動(dòng)子的活性區(qū)域,我們對(duì)CUEDC2啟動(dòng)子p600做了不同長(zhǎng)度的截短,發(fā)現(xiàn)CUEDC2啟動(dòng)子p600的活性區(qū)域在它的

6、3’端。為了找到和啟動(dòng)子p600結(jié)合的蛋白,我們把鏈霉親和素磁珠和CUEDC2啟動(dòng)子p600偶聯(lián),和HEK293T細(xì)胞核提取物孵育,經(jīng)SDS-PAGE分離后銀染,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較有一條有差異的銀染條帶。
　　為了進(jìn)一步研究CUEDC2的功能,我們構(gòu)建了CUEDC2條件打靶載體和非條件打靶載體,為了篩選中靶細(xì)胞,針對(duì)打靶載體設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了Southern印記雜交用的探針。打靶載體電轉(zhuǎn)小鼠ES細(xì)胞后,通過(guò)正負(fù)篩選標(biāo)記篩選和Southe