HBV通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子AP-2α調(diào)節(jié)Raf1啟動(dòng)子活性.pdf

1、目的：
　　研究HBV增強(qiáng)Raf1表達(dá)的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.構(gòu)建Raf1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和5'缺失的Raf1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測(cè)Raf1啟動(dòng)子活性，以確定Raf1啟動(dòng)子主要作用區(qū)域。
　　2.將構(gòu)建的5'缺失的Raf1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別與HBx表達(dá)質(zhì)粒pCMV-sport6-HBx或?qū)φ召|(zhì)粒pCMV-sport6共轉(zhuǎn)染入HepG2

2、細(xì)胞，研究HBx與Raf1啟動(dòng)子主要作用區(qū)域的關(guān)系，再用RNA干擾的方法抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBx，對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　3.在HepG2.2.15細(xì)胞中，AP-2α表達(dá)質(zhì)粒與5'缺失的Raf1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，AP-2α干擾質(zhì)粒與5'缺失的Raf1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，分別驗(yàn)證AP-2α對(duì)Raf1啟動(dòng)子活性的影響。
　　4.用RT-PCR，Real-Time PCR和Western Bl

3、ot的方法驗(yàn)證在HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞中AP-2α的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：
　　1.熒光素酶活性分析結(jié)果顯示-209～-133bp是Raf1啟動(dòng)子上的主要作用區(qū)域。
　　2.-209～-133bp區(qū)域是HBx增強(qiáng)Raf1啟動(dòng)子活性過(guò)程中主要作用區(qū)域。
　　3.轉(zhuǎn)錄因子AP-2α可以增強(qiáng)Raf1啟動(dòng)子活性，在HepG2.2.15細(xì)胞抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-2α后，Raf1啟動(dòng)子活性明顯下降。