結締組織生長因子VHH納米抗體庫的構建、篩選及在脂多糖誘導小鼠急性肺損傷中作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　重鏈抗體(Heavy-chain antibodies，HCAbs)是一種新型的抗體類別，該類抗體缺失輕鏈和抗體CH1恒定區(qū)，僅由重鏈構成;其重鏈可變區(qū)(Variable domain of the H chain of Heavy Chain Antibody,VHH)的單一結構域構成了這類抗體的抗原結合位點，打破了重鏈和輕鏈共同構成抗體-抗原結合域的規(guī)則，盡管缺失輕鏈可變區(qū)，但仍具有完全的抗原結合力。自1993

2、年Hamers發(fā)現(xiàn)單峰駝血清中天然存在重鏈抗體以來，研究者在全部駱駝科動物如單峰駝、雙峰駝、羊駝等體內均證實了這類抗體的存在。利用基因工程技術克隆重鏈抗體的可變區(qū)可獲得VHH抗體，也稱為納米抗體(Nanobody)。VHH納米抗體是目前所發(fā)現(xiàn)的具有完整功能的最小分子抗體片段，分子量約為15kDa，僅為常規(guī)抗體的1/10。VHH納米抗體具有分子量小、可溶性強、穩(wěn)定性高、易于克隆篩選及人源化改造等獨特優(yōu)勢，對疾病的診斷和治療等方面具有重要的

3、意義。
　　在前期研究中，通過噬菌體展示技術獲得了人源抗CTGF單鏈抗體Anti-CTGF scFv(Genbank Access NO.GQ390339);實驗研究顯示Anti-CTGF scFv能夠抑制肺成纖維細胞向肌成纖維細胞表型的轉換，并對博來霉素所致小鼠肺纖維化具有一定的抑制作用。前期Anti-CTGF scFv的研究為本研究提供了一定的基礎，但肺纖維化疾病是多種病因引起的肺部破壞性疾病的終末期階段，一般認為肺纖維化病程

4、不可逆轉且以早期肺炎癥及肺損傷為特征，因此，在肺部病變改變的早期階段進行藥物干預或治療具有更好的治療效果。
　　研究目的：
　　構建結締組織生長因子VHH納米抗體文庫，篩選獲取CTGF特異性的VHH納米抗體;通過基因工程的方法表達制備高純度的CTGF VHH納米抗體;研究其在脂多糖誘導小鼠急性肺損傷中的作用，初步建立新一代基因工程抗體片段即VHH納米抗體的研究方法，為進一步探索其臨床價值提供依據。
　　研究方法：

5、>　　1.重組結締組織生長因子C端(CT)抗原的制備:構建CTGF-C端(CT)原核表達載體，轉化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導融合蛋白表達，經鎳親和層析、腸激酶酶切等步驟制備目的蛋白CTGF-C端(CT)，并進行SDS-PAGE、ELISA和Western Blot分析;CCK-8和Transwell實驗考察其在細胞增殖和遷移中的活性。2.結締組織生長因子VHH納米抗體文庫的構建:CTGF-C端(CT)蛋白免疫雙

6、峰駝，RT-PCR獲得全套雙峰駝VHH抗體基因，將其克隆到噬菌體載體并與編碼噬菌體衣殼蛋白的基因相連接，展示于噬菌體表面，構建雙峰駝VHH納米抗體文庫。3.CTGF特異性VHH納米抗體的生物淘選:采用親和淘選技術，包被純化的重組抗原CTGF-C端(CT)，進行“吸附-洗脫-擴增”的生物淘選，逐輪改變抗原包被濃度和洗滌壓力，富集特異性結合CTGF-C端(CT)的噬菌體，從而篩選獲得CTGF特異性VHH納米抗體。4.CTGF VHH納米抗體

7、的表達純化與活性的初步研究:構建VHH納米抗體表達載體，轉化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導融合蛋白表達，經鎳親和層析純化制備VHH納米抗體并檢測其活性。5.CTGFVHH納米抗體在脂多糖誘導小鼠急性肺損傷中作用的研究:氣管內注射LPS誘導建立小鼠急性肺損傷模型(ALI)，CTGFVHH納米抗體干預ALI，給藥24h和48h處死動物，分離肺部組織并收集肺泡灌洗液，觀察肺組織病理改變、肺泡灌洗液細胞分類計數等指標，初步

8、探討CTGFVHH納米抗體在LPS所致小鼠急性肺損傷中的作用。
　　研究結果：
　　1.重組結締組織生長因子C端(CT)抗原的制備:融合蛋白TrxA-His-CTGF-C在BL21(DE3)主要以可溶性形式表達，分離純化獲得了純度大于95％的CTGF-C端(CT)蛋白。ELISA和Western Blot分析顯示其與Anti-CTGF具有良好的結合活性。細胞實驗顯示，一定濃度的純化CTGF-C端(CT)蛋白，可以促進人臍靜脈

9、內皮細胞和人近曲腎小管上皮細胞的細胞增殖和遷移。免疫學實驗及細胞學實驗顯示，分離純化所獲目的蛋白CTGF-C端(CT)具有良好的生物活性，能夠滿足后續(xù)相關實驗需求。2.結締組織生長因子VHH納米抗體文庫的構建:免疫后雙峰駝血清中抗CTGF抗體滴度水平達1∶128，000;瓊脂糖凝膠電泳顯示，巢式PCR第二輪產物在約400bp處有特異性條帶，大小與VHH基因一致;將VHH基因片段用限制性內切酶NcoⅠ-HF和NotⅠ-HF消化后與噬菌粒載

10、體pHEN2連接，電轉化XL1-Blue感受態(tài)細胞，培養(yǎng)板陽性克隆子計數約為1.6×109，PCR鑒定VHH基因片段的插入率為93％，所構建VHH抗體庫庫容量為1.49×109CFU;隨機挑取20個陽性克隆，測序結果均不相同，顯示所構建VHH抗體庫具有良好的多樣性。3.CTGF特異性VHH抗體的生物淘選:測序結果顯示，12個克隆測序中，其中9個克隆展示的核苷酸序列完全相同，轉化為氨基酸序列后，命名為Nb1，即CTGF特異性納米抗體(Ge

11、nBank Access:NO.KX428017)。4.CTGF VHH納米抗體的表達純化與活性的初步研究:VHH納米抗體在大腸桿菌以可溶性的形式表達，經鎳親和層析純化獲得該抗體純度大于95％;ELISA實驗表明，該抗體能和CTGF-C端(CT)特異性結合并具有較高的親和力;且該抗體能夠抑制CTGF-C端(CT)引起的促BEAS-2B、MRC-5和HLEF細胞的細胞增殖活性。5.CTGF VHH納米抗體在脂多糖誘導小鼠急性肺損傷中作用的

12、研究:氣管內注射LPS后成功建立小鼠急性肺損傷模型，肺組織切片HE染色和Masson染色顯示，該模型具有典型的肺泡結構的受損、萎縮甚至結構消失，肺組織內可見大量彌漫性炎性細胞的浸潤等特征;在給予VHH納米抗體干預后小鼠肺泡及間質炎癥均明顯減輕;肺泡灌洗液中性粒細胞計數較LPS模型組明顯降低（P＜0.05);同時，CTGF VHH納米抗體明顯降低了小鼠BALF和血清中TNF-α及IL-1β水平;與LPS模型組比較，VHH納米抗體治療組小鼠

13、肺組織p65蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)，但未觀察到磷酸化p65蛋白表達水平的明顯改變。
　　研究結論：
　　成功構建了庫容量較高、基因多樣性良好的噬菌體展示VHH納米抗體文庫;生物淘選獲得CTGF特異性VHH納米抗體;該抗體能夠抑制CTGF-C端(CT)引起的促BEAS-2B、MRC-5和HLEF細胞的細胞增殖活性，并且能夠LPS所致小鼠急性肺損傷中炎癥和損傷程度，其分子機制可能與降低P65表達水平，抑制NF-κB