MNNG誘導人核糖核苷酸還原酶小亞基RRM2-p53R2基因轉(zhuǎn)錄機制的研究.pdf

1、MNNG作為一種單功能烷化劑，被認為是環(huán)境中廣泛存在的化學致癌物。其可以導致DNA斷裂、基因突變甚至腫瘤的發(fā)生。MNNG誘導的DNA損傷反應可以激活許多修復相關基因。核糖核苷酸還原酶（RNR）催化核糖核苷二磷酸還原為脫氧核糖核苷二磷酸，在DNA合成和修復過程中起重要作用。人核糖核苷酸還原酶由兩個相同的大亞基（RRM1）和兩個相同的小亞基（RRM2或p53R2）組成兩種RR酶，即RRM1-RRM2和RRM1-p53R2。那么MNNG是否可

2、以影響細胞中RRM2或p53R2的表達水平，以及通過何種途徑影響至今沒有相關報道。
　　本文研究了MNNG誘導RRM2和p53R2轉(zhuǎn)錄上調(diào)的作用和機制。(1)我們發(fā)現(xiàn)MNNG可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑誘導RRM2和p53R2基因表達上調(diào)，但不影響RRM1的表達水平。而且，MNNG不僅可以誘導RRM2/p53R2的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，同時也導致了它們的核轉(zhuǎn)位。(2)通過檢測MNNG處理前后p-H2AX水平，細胞周期分布及細胞凋亡比例，我們發(fā)現(xiàn)RRM

3、2主要參與MNNG誘導的DNA損傷修復過程，而p53R2的作用相對較弱。(3)通過DNA pull-down偶聯(lián)LC-MS/MS篩選、以及ChIP-qPCR和免疫印跡法驗證，我們發(fā)現(xiàn)MNNG處理KB細胞后，轉(zhuǎn)錄因子E2F3、E2F1及NFY結合到RRM2啟動子。結合位點鄰近于E2F結合序列的NFY可以加強E2F3和E2F1結合到RRM2啟動子上。通過使用免疫共沉淀技術分析發(fā)現(xiàn)NFY與E2F3在細胞內(nèi)存在相互作用。報告基因?qū)嶒灲Y果顯示相較

4、于E2F1，E2F3可以顯著激活RRM2的啟動子報告基因活性。在KB細胞系中，過表達E2F3能夠增加RRM2的表達，從而降低MNNG誘導的p-H2AX水平。通過小RNA干擾E2F3可以有效抑制MNNG誘導的RRM2表達上調(diào)，進而增強p-H2AX水平。(4)有趣的是，MNNG主要通過翻譯后修飾導致E2F3水平上調(diào)。同時，我們也發(fā)現(xiàn)MNNG可以快速誘導NFYA和NFYB mRNA水平的上調(diào)。上調(diào)的NFY入核與E2F3聯(lián)合調(diào)控RRM2的轉(zhuǎn)錄。

5、(5)為了進一步探究E2F3表達上調(diào)的分子機制，我們研究了E2F3上游可能的信號激酶。結果顯示MNNG是通過激活ATR-CHK1-E2F3信號通路上調(diào)E2F3蛋白水平，從而轉(zhuǎn)錄激活RRM2基因，參與DNA修復。對于p53R2，我們發(fā)現(xiàn)MNNG誘導其轉(zhuǎn)錄上調(diào)不僅依賴于p53，同時也依賴于E2F1。而MNNG誘導的RRM2轉(zhuǎn)錄上調(diào)主要依賴于E2F3和NFY。
　　綜上所述，本文結果表明RNR參與化學致癌物MNNG誘導的DNA損傷修復，