大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬新生顆粒細胞樹突的發(fā)育特征.pdf

1、研究背景和目的：
　　哺乳類動物海馬齒狀回是終生具有產(chǎn)生顆粒細胞能力的腦結構。位于齒狀回顆粒下區(qū)的神經(jīng)干細胞在受到刺激后分化、發(fā)育為成熟顆粒細胞，同時整合至齒狀回神經(jīng)網(wǎng)絡。嚙齒類動物成年新生顆粒細胞在新生后在經(jīng)歷不同發(fā)育階段后，約需2個月成為與已經(jīng)存在顆粒細胞在形態(tài)、電生理學性質(zhì)和突觸聯(lián)系相似的成熟顆粒細胞。成年顆粒細胞新生與海馬相關的學習、記憶形成以及情緒調(diào)節(jié)密切相關。許多生理、病理因素可以顯著改變成年海馬齒狀回神經(jīng)新生。癲癇持

2、續(xù)狀態(tài)后海馬齒狀回神經(jīng)新生出現(xiàn)短暫增強。迄今，在癲癇發(fā)生中神經(jīng)新生增強的意義尚存爭議。借助于逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的綠色熒光蛋白(GFP)基因?qū)π律w粒細胞的標識以及共聚焦成像，本課題研究了匹羅卡品誘導的癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細胞在發(fā)育過程中樹突形態(tài)、樹突棘密度和細胞活性的變化。
　　材料和方法：
　　材料:
　　實驗動物為雄性SD大鼠（140-170 g，6-7周齡）。
　　方法:
　　1.癲癇持續(xù)狀態(tài)的誘導以及

3、齒狀回內(nèi)注射逆轉(zhuǎn)錄病毒載體癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)以腹腔內(nèi)注射匹羅卡品誘導。選取對Racine氏SE分級Ⅱ級或以上、發(fā)作時間長于2小時的大鼠進行后續(xù)實驗。以腹腔內(nèi)生理鹽水注射的同齡動物作為對照。CAG-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在SE誘導第5天以立體定向技術注入海馬齒狀回。
　　2.灌流和切片制作
　　在CAG-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體齒狀回內(nèi)注射5天、28天或至少70天后，腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉麻醉動物后，用4％多聚甲醛經(jīng)心臟對腦進行灌流

4、固定。取腦后，以4％多聚甲醛對腦進行后固定過夜。在以10％-15％-20％蔗糖磷酸緩沖液對樣本進行沉糖處理后，以明膠-白蛋白-戊二醛混合液包埋組織塊，經(jīng)振動切片機制作厚度為100μ m或40μ m的海馬冠狀切片。
　　3.免疫熒光染色
　　GFP免疫熒光染色:在普通熒光顯微鏡下，挑選出含有GFP細胞的100μ m厚切片。對腦片進行免疫熒光染色，所用一抗和二抗分別山羊抗GFP以及和Alexa fluor488結合的驢抗山羊Ig

5、G。Arc免疫熒光染色:在普通熒光顯微鏡下，挑選出含有GFP細胞的40μm厚切片。對腦片進行免疫熒光染色，所用一抗和二抗分別為兔抗Arc以及和Alexa fluor568結合的驢抗兔IgG。NeuN免疫熒光染色:在普通熒光顯微鏡下，挑選出含有GFP陽性細胞(GFP+)的40μm厚切片。對腦片進行免疫熒光染色，所用一抗和二抗分別為鼠抗NeuN以及和Alexa fluor568結合的驢抗鼠IgG。
　　4.樹突復雜性分析
　　對

6、分布于齒狀回上支、少與其它細胞重疊、樹突分支基本完整的細胞進行z軸連續(xù)序列掃描，以此獲取神經(jīng)元胞體以及樹突的3D圖片。應用ZEN軟件對該3D圖片進行z軸最大密度投影。在Image J中打開投影后細胞圖像，手動描繪出細胞胞體和樹突。樹突復雜程度以Sholl法進行分析:以神經(jīng)元胞體中心為圓心，每隔25μ m劃一同心圓。樹突與同心圓交點的數(shù)目代表樹突復雜性。
　　5.樹突棘密度分析
　　對于位于齒狀回上支的每一個GFP+顆粒細胞，

7、隨機選取中段和末段樹突各3段進行高倍鏡下的z軸系列掃描，建立各段樹突的3D圖像，在Image J中對樹突棘進行計數(shù)。樹突棘密度以樹突棘數(shù)目除以樹突長度計算。
　　6.Arc熒光強度分析
　　共聚焦拍攝GFP陽性以及周圍GFP陰性細胞(GFP-) Arc熒光圖像后，應用Image J軟件對GFP陽性顆粒細胞Arc熒光強度進行測定。隨機選取同張照片外分子層的10個顆粒細胞，測其Arc熒光強度，計算這些GFP陰性細胞的平均Arc熒

8、光強度。GFP+神經(jīng)元的活動水平以GFP+神經(jīng)元的Arc熒光強度值與GFP-細胞Arc熒光強度均值的比值來表示。
　　7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計
　　定量數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，以Grahpad軟件進行統(tǒng)計學檢驗。P≤0.05，考慮為有統(tǒng)計學差異。
　　結果:
　　1.正常生理條件下和癲癇病理條件下，大鼠海馬齒狀回均有成年后神經(jīng)新生現(xiàn)象，應用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的GFP標識方法標記的細胞類型有顆粒細胞和膠質(zhì)細胞。GFP+顆粒細胞分

9、布于顆粒細胞層內(nèi)1/3，GFP在胞體、軸突、樹突均有表達。
　　2.與對照組同齡顆粒細胞相比，癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細胞在未成熟階段(4周齡)樹突復雜度更高，而在成熟后（10周齡），樹突復雜度沒有差異。
　　3.與對照組同齡顆粒細胞相比，癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細胞在未成熟階段(4周齡)位于中分子層的樹突棘密度（對照組:1.96±0.05個/μm，n=5;癲癇組:2.23±0.04個/μm，n=4）和蘑菇狀樹突棘密度（對照組:

10、0.06±0.002個/μm， n=5;癲癇組:0.07±0.002個/μm，n=4）更高。而癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細胞成熟后（10周齡）與對照組同齡顆粒細胞相比，位于外分子層的蘑菇狀樹突棘密度（對照組:0.10±0.007個/μm，n=6;癲癇組:0.13±0.01個/μm，n=6）更高。
　　4.對照組和癲癇組未成熟GFP+細胞（4周齡）Arc的熒光強度與周圍成熟GFP-顆粒細胞Arc的熒光強度平均值的比值分別為（1.54±0

11、.13，n=3）和(1.45±0.17，n=7)，活動水平高于周圍成熟顆粒細胞。對照組和癲癇組成熟GFP+細胞（10周齡）Arc的熒光強度與周圍已成熟GFP-顆粒細胞Arc的熒光強度平均值的比值分別為（1.18±0.10，n=6）和（0.98±0.04，n=6），活動水平與周圍成熟顆粒細胞相近。
　　結論:
　　與自然狀態(tài)下新生的顆粒細胞相比，癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細胞呈現(xiàn)樹突和細胞活動度的發(fā)育性改變。癲癇持續(xù)狀態(tài)后4周齡新