結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤分子標(biāo)志物的篩查及其生長機制初探.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分基于iTRAQ定量蛋白組學(xué)技術(shù)對結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤差異蛋白的鑒定及篩選
　　目的:通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定并分析出結(jié)直腸LSTs特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，以期找到導(dǎo)致其側(cè)向生長發(fā)育的可能的分子機制;同時探知與其病情進(jìn)展相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)記物，提高結(jié)直腸LSTs的早期診斷率、療效以及改善預(yù)后。
　　方法:隨機收取結(jié)直腸LSTs、大腸隆起型腺瘤性息肉、大腸小的扁平腺瘤型息肉(d＜1cm)

2、、大腸癌及正常對照組大腸組織標(biāo)本，每組各20例。分別從各組織樣品中提取蛋白，加入胰酶消化，酶解后的多肽用同位素相對與絕對定量(iTRAQ)試劑進(jìn)行標(biāo)記，混合標(biāo)記后的肽段，用強陽離子交換柱(SCX)和反相色譜柱（RPLC）進(jìn)行二維分離，然后經(jīng)基于QE的液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜分析并進(jìn)行蛋白質(zhì)定量鑒定，通過Mascot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索得到結(jié)直腸LSTs患者的差異蛋白質(zhì)譜，并對其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)生物信息分析。
　　結(jié)果:本研究通過同位素相對絕對定

3、量(iTRAQ)技術(shù)聯(lián)合多維固/液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)研究策略，共鑒定到4955個蛋白，22587個肽段，其中含21095個Unique肽段。經(jīng)過比對分析，共有2001個蛋白被鑒定為差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白數(shù)量分別為:結(jié)直腸LSTs組/正常對照組361，結(jié)直腸LSTs組/隆起型腺瘤組189，結(jié)直腸LSTs組/扁平腺瘤組151，結(jié)直腸LSTs組/大腸癌組325;下調(diào)蛋白數(shù)量分別為:結(jié)直腸LSTs組/正常對照組318，結(jié)直

4、腸LSTs組/隆起型腺瘤組201，結(jié)直腸LSTs組/扁平腺瘤組153，結(jié)直腸LSTs組/大腸癌組303;總差異蛋白數(shù)量分別為:結(jié)直腸LSTs組/正常對照組679，結(jié)直腸LSTs組/隆起型腺瘤組390，結(jié)直腸LSTs組/扁平腺瘤組304，結(jié)直腸LSTs組/大腸癌組628。（注:當(dāng)?shù)鞍棕S度差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計檢驗其P小于0.05時，視為差異蛋白。）
　　進(jìn)一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸LSTs存在著特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，即結(jié)直腸

5、LSTs與大腸隆起型腺瘤性息肉、大腸小的扁平腺瘤型息肉、大腸癌組織及正常大腸粘膜組織相比，均存在著相同的差異性表達(dá)的蛋白質(zhì)共55個:共同上調(diào)的差異蛋白質(zhì)14個，共同下調(diào)的差異蛋白質(zhì)41個。根據(jù)GO功能注釋分析，被鑒定出的結(jié)直腸LSTs差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中，具有結(jié)合功能的差異蛋白所占比例為49.54％，其次是具有酶催化活性作用的蛋白占28.39％，具有酶調(diào)節(jié)活性功能的差異蛋白占4.51％，其余差異表達(dá)的蛋白質(zhì)涉及免疫防御反應(yīng)、血管新生等功能

6、。而被鑒定出的結(jié)直腸LSTs55個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中以具有結(jié)合功能和運輸代謝功能的蛋白質(zhì)為主。
　　結(jié)論:通過iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，我們成功地鑒定出了結(jié)直腸LSTs差異表達(dá)的蛋白質(zhì)譜，并篩選出一批結(jié)直腸LSTs特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中多種蛋白質(zhì)具有結(jié)合功能、酶調(diào)節(jié)活性功能和運輸代謝等功能，提示結(jié)直腸LSTs差異表達(dá)的蛋白質(zhì)參與的細(xì)胞代謝過程與功能通路在其病程進(jìn)展過程中發(fā)揮了重要的作用。
　　第二部分結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育型腫

7、瘤分子標(biāo)志物的驗證與診斷評價
　　目的:對與結(jié)直腸LSTs特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及驗證。
　　方法:隨機收取LSTs及正常對照組血清標(biāo)本，每組各20例。應(yīng)用RT-PCR的方法對結(jié)直腸LSTs組、隆起型腺瘤組、扁平腺瘤組、大腸癌組及正常對照組大腸組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行mRNA水平的驗證。應(yīng)用westemblot的方法驗證LCN-2、MMP-9蛋白在結(jié)直腸LSTs、隆起型腺瘤、扁平腺瘤、大腸癌及正常大腸組織中的表達(dá)。采用

8、ELISA雙抗夾心法和免疫組織化學(xué)驗證LCN-2、MMP-9蛋白在結(jié)直腸LSTs及正常大腸組織中的表達(dá)水平。組間比較采用獨立樣本t檢驗（Independent-Samples t Test）或單向方差分析(One-way ANOVA)及后續(xù)的基于方差分析的多重比較方法（滿足方差齊性時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett's T3法），Spearman（非雙變量正態(tài)分布資料或者等級資料，相關(guān)系數(shù)用rs表示）相關(guān)系數(shù)分析LCN2與MM

9、P9蛋白表達(dá)以及免疫組化結(jié)果與臨床病理特征的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:我們選擇了4個與腫瘤病情進(jìn)展密切相關(guān)但目前在LSTs研究領(lǐng)域報道較少的蛋白即LCN-2、SORD、RAB25、CPA3先進(jìn)行Real Time PCR實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，結(jié)直腸LSTs組中LCN-2、SORD、RAB25 mRNA表達(dá)顯著升高（P值分別為0.000，0.000，0.043），CPA3 mRNA表達(dá)顯著下降(P

10、=0.000)，其中LCN-2 mRNA在5組組織中差異表達(dá)的趨勢與蛋白組學(xué)結(jié)果最為一致。隨后對LCN-2及與其功能密切相關(guān)的且在LSTs組織中顯著上調(diào)的MMP9蛋白進(jìn)行Western blot、免疫組化驗證，發(fā)現(xiàn)LCN-2、MMP9在結(jié)直腸LSTs組織中的表達(dá)較正常組顯著升高（P值分別為0.000，0.000）;且二者在組化中的表達(dá)強度相關(guān)分析結(jié)果表明:MMP-9蛋白表達(dá)與LCN-2蛋白表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系(rs=0.631，P=0.0

11、00);且LCN-2、MMP-9蛋白表達(dá)均與病理分級存在正相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)分別為rs=0.943，P=0.000; rs=0.684，P=0.000）。結(jié)直腸LSTs患者血清LCN-2、MMP-9蛋白濃度均顯著高于正常對照組(P值分別為0.000，0.000); MMP-9蛋白表達(dá)與LCN-2蛋白表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系(rs=0.815，P=0.000);且LCN-2、MMP-9蛋白表達(dá)均與病理分級存在正相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)分別為rs=0.

12、927，P=0.000; rs=0.924，P=0.000）。
　　結(jié)論:經(jīng)質(zhì)譜分析篩選出來的差異蛋白中，LCN-2和MMP-9在結(jié)直腸LSTs患者腫瘤組織及血清中的表達(dá)水平均顯著增高，且LCN-2在LSTs組織中的表達(dá)與其病理分級程度呈正相關(guān)，提示LCN-2和MMP-9可能與LSTs病情發(fā)展密切相關(guān)，為結(jié)直腸LSTs病情進(jìn)展及分子標(biāo)志物的研究提供了新的實驗依據(jù)。LCN-2蛋白對于提高結(jié)直腸LSTs早期診斷率及改善預(yù)后具有較大的臨

13、床應(yīng)用價值，可能成為預(yù)測結(jié)直腸LSTs診斷、預(yù)后監(jiān)測和防治的重要指標(biāo)。
　　第三部分結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤生長機制的初步探討
　　目的:利用蛋白組學(xué)技術(shù)初步探討結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤的側(cè)向發(fā)育生長機制。
　　方法:通過透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy，TEM)研究結(jié)直腸LSTs、隆起型腺瘤及正常大腸黏膜組織的超微結(jié)構(gòu)，觀察三者細(xì)胞間的連接方式，看是否找到與結(jié)直腸LSTs側(cè)向生

14、長發(fā)育相關(guān)的異常結(jié)構(gòu)。應(yīng)用western blot、免疫組化的方法驗證橋粒家族蛋白DSG2、PKP3、JUP在結(jié)直腸LSTs、隆起型腺瘤及正常大腸組織中的表達(dá)。組間比較采用單向方差分析(One-way ANOVA)及后續(xù)的基于方差分析的多重比較方法（滿足方差齊性時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett's T3法），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:透射電子顯微鏡(TEM)研究結(jié)直腸LSTs、隆起型腺瘤及正常大腸黏膜

15、組織的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)橋粒數(shù)量及密度在基底層、中間層表達(dá)正常，但在上皮側(cè)，結(jié)直腸LSTs橋粒的數(shù)量及密度較隆起型腺瘤及正常大腸黏膜組織顯著升高（P值分別為0.000，0.000），而且結(jié)直腸LSTs上皮側(cè)橋粒的數(shù)量及密度最高。用Western blot、免疫組化的實驗方法證實DSG2、 PKP3及JUP的蛋白表達(dá)量在結(jié)直腸LSTs及隆起型腺瘤中較正常大腸黏膜組織顯著升高(P值分別為0.000，0.000)，且在結(jié)直腸LSTs中表達(dá)量最高。