GRK3在雄激素剝奪療法誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌中的作用研究.pdf

1、前列腺癌是非常常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在西方國家也是最常見的惡性腫瘤，尤其在美國，前列腺癌患者的發(fā)病率仍超過肺癌，高居第一位。近年來，在我國前列腺癌患者發(fā)病率逐漸呈增長趨勢。前列腺癌由于癥狀隱蔽，至少50％的患者確診時已為局部晚期腫瘤，治療并預(yù)防轉(zhuǎn)移對提高生存率尤為重要。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)也是患者死亡的主要原因。神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞已被公認(rèn)為是正常前列腺管道和腺泡的一個組成部分。近50％的臨床型前列腺癌有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞異變。神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺

2、癌(neuroendocrine differentiation of prostate cancer, NEPC)，也稱為未分化小細(xì)胞癌，是一種高侵襲性前列腺癌的亞型。它可以是原發(fā)性的，但其大多數(shù)來自前列腺腺癌(Prostate adenocarcinoma, PCA)的晚期并進(jìn)行激素治療之后。神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌NEPC不同于前列腺癌PCA，NEPC的特點是存在神經(jīng)內(nèi)分泌(neuroendocrine，NE)細(xì)胞、不表達(dá)雄激素受體(

3、androgenreceptor, AR)、不分泌前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)，但通常高表達(dá)神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物，如嗜鉻粒蛋白A(chromogranin A，CHGA)嗜鉻粒蛋白B(chromogranin B，CHGB)，突觸小泡蛋白，特定神經(jīng)元烯醇酶2(enolase2，ENO2)。臨床研究表明，患者長期應(yīng)用雄激素剝奪療法（androgen deprivation therapy，AD

4、T）可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)。因此去勢抵抗型前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)的發(fā)生率，可能會隨著臨床引入雄激素剝奪療法的增加而增加，導(dǎo)致一個高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性的臨床過程。因此，闡明NEPC發(fā)生的分子機(jī)制以及開發(fā)NEPC的靶向治療藥物是目前前列腺癌領(lǐng)域的一個研究熱點。
　　最新研究表明，人類G蛋白耦合受體激酶3(G protein-coupled receptorkin

5、ases3，GRK3)是前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中所必不可少的激酶，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程。因為NEPC是具有高轉(zhuǎn)移性質(zhì)的一種前列腺癌的亞型，因此，我們考慮是否GRK3在前列腺腺癌細(xì)胞的NE分化過程中是否也發(fā)揮了重要的作用。
　　本研究中，我們通過無激素培養(yǎng)誘導(dǎo)前列腺腺癌細(xì)胞LNCaP向NE方向轉(zhuǎn)化，制備了雄激素剝奪療法(Androgen deprivation treatment，ADT)誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌細(xì)胞，命名為t-

6、NEPC(ADT-induced NEdifferentiated cell line)。并研究了LNCaP向t-NEPC細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程當(dāng)中蛋白激酶GRK3的作用。該研究的目的是為了NEPC的治療提供新的治療靶點和實驗依據(jù)。
　　目的:制備ADT誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌細(xì)胞，并研究在前列腺腺癌細(xì)胞向神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)化的過程中蛋白激酶GRK3的作用，為NEPC的治療提供新的治療靶點和實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)

7、
　　人類前列腺腺癌LNCaP細(xì)胞在含5％的胎牛血清、濃度分別為1％的谷氨酰胺和1％的青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
　　t-NEPC細(xì)胞在含5％的無激素胎牛血清、濃度分別為1％的谷氨酰胺和1％的青霉素和鏈霉素的無激素RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
　　2、實驗方法
　　采用無激素RPMI1640培養(yǎng)基誘導(dǎo)人類前列腺腺癌LNCaP細(xì)胞向神經(jīng)內(nèi)分泌方向轉(zhuǎn)化，成功制備人前列腺腺癌細(xì)胞來源的神經(jīng)內(nèi)分泌t

8、-NEPC細(xì)胞，采用Real time PCR檢測兩種細(xì)胞當(dāng)中PSA、AR以及NE標(biāo)志物CHGA、CHGB和ENO2的表達(dá)變化，通過Real time PCR和westernblot方法檢測兩種細(xì)胞中GRK3的表達(dá)變化。采用病毒感染方法建立穩(wěn)定表達(dá)shGRK3的t-NEPC細(xì)胞，并采Real time PCR方法檢測敲低GRK3后t-NEPC細(xì)胞中NE標(biāo)志物CHGA、CHGB和ENO2的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1、ADT

9、可誘導(dǎo)人類前列腺腺癌LNCaP細(xì)胞向神經(jīng)內(nèi)分泌方向分化
　　首先我們通過在去激素的RPMI1640，含5％的胎牛血清、濃度分別為1％的谷氨酰胺和1％的青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基中，長期培養(yǎng)LNCaP細(xì)胞從而得到t-NEPC細(xì)胞。這些細(xì)胞是來源于長期用ADT治療的人類前列腺腺癌LNCaP細(xì)胞。結(jié)果顯示，LNCaP細(xì)胞顯示上皮形態(tài)，而t-NEPC細(xì)胞可見包體變圓，周圍出現(xiàn)很多神經(jīng)元樣細(xì)胞突觸，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化。我們又通過實時定量PCR在

10、LNCaP和t-NEPC這兩個細(xì)胞系中比較 AR的表達(dá)以及其目標(biāo)基因前列腺特異性抗原(PSA)兩種NE標(biāo)記物的表達(dá)。結(jié)果顯示，PSA在LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)比在t-NEPC細(xì)胞中高出10倍，AR在LNCaP細(xì)胞比在t-NEPC胞中的表達(dá)也高出了5倍，在LNCaP細(xì)胞中CHGA上升了6倍，CHGB上升了4倍，ENO2上升了20倍。
　　2、GRK3在人類前列腺腺癌向神經(jīng)內(nèi)分泌方向分化的表達(dá)變化
　　我們研究了GRK3在LNCa

11、P和t-NEPC細(xì)胞中的表達(dá)。Western-blot結(jié)果顯示與LNCaP細(xì)胞相比GRK3在ADT-誘導(dǎo)的t-NEPC細(xì)胞中的蛋白水平明顯升高;而通過實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，ADT-誘導(dǎo)的t-NEPC細(xì)胞與LNCaP細(xì)胞相比顯著上升了兩倍.
　　3、敲除GRK3后對t-NEPC表型的影響
　　我們用GRK3 shRNA感染t-NEPC細(xì)胞后，首先觀察了細(xì)胞的形態(tài)變化，細(xì)胞轉(zhuǎn)染GRK3 shRNA后，細(xì)胞觸角減少，形態(tài)發(fā)生

12、逆轉(zhuǎn)變化，然后我們又通過實時定量PCR方法檢測了t-NEPC shscramble和t-NEPCshGRK3以此評估敲除GRK3實驗是否成功，結(jié)果顯示:t-NEPC shGRK3組的表達(dá)明顯低于對照組t-NEPC shscramble3倍，GRK3 shRNA被感染成t-NEPC細(xì)胞減少了內(nèi)源性GRK3，GRK3敲除成功。我們進(jìn)一步進(jìn)行了NE標(biāo)志物:CHGA CHGB和ENO2的表達(dá)，通過實時定量PCR分析t-NEPC shGRK3較對