骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌因子對(duì)缺血性腦卒中后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及功能的影響.pdf

1、本文分以下幾章進(jìn)行探討：
　　第一章 BMSCs旁分泌因子對(duì)大鼠MCAO模型腦損傷及損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性和反應(yīng)性增生的影響
　　目的：觀察BMSCs及BMSC-CM（含旁分泌因子）對(duì)MCAO后大鼠腦梗塞面積和神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，推斷BMSCs旁分泌因子在急性期缺血性腦損傷修復(fù)過(guò)程中對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性和反應(yīng)性增生的作用。
　　方法：構(gòu)建大鼠MCAO模型，在急性期（即栓塞2h，再灌注6h后）應(yīng)用立體定向注射技術(shù)，依組分別

2、向MCAO模型鼠損傷灶注射PBS（Venicle組）、BMSCs（BM組）或BMSC-CM（含旁分泌因子，CM組）對(duì)缺血性腦損傷進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療。7d后，TTC染色法檢測(cè)腦梗塞面積;改良NSS評(píng)分評(píng)估神經(jīng)功能恢復(fù)情況;TUNEL檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，免疫熒光和Western bolt檢測(cè)Caspase3和GFAP蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：以下各組，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。局灶注射BMSC-CM（BM組）及BMSC-CM（C

3、M組）均能夠有效減少腦梗塞面積，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，與對(duì)照組（Venicle組）比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，且BM組的改善效果比CM組更加明顯(p＜0.05)。另外，BMSC-CM及BMSC-CM均能減少損傷灶神經(jīng)細(xì)胞的凋亡(p＜0.05)，抑制凋亡蛋白Caspase3的表達(dá)(p＜0.05)，且對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生具有明顯抑制作用，顯著減少GFAP的蛋白表達(dá)(p＜0.05)。
　　結(jié)論：BMSC-CM（含旁分泌

4、因子）對(duì)MCAO模型鼠的干預(yù)，與移植的BMSCs具有相似的治療效果，能有效減少腦梗塞面積，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，并能減少損傷灶神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生。提示，移植的BMSCs能通過(guò)旁分泌因子發(fā)揮上述療效。
　　第二章 BMSCs旁分泌因子對(duì)OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及反應(yīng)性增生的影響及機(jī)制探討
　　目的：進(jìn)一步探討B(tài)MSCs旁分泌因子對(duì)缺血性損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和反應(yīng)性增生的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。
　　方

5、法：以體外構(gòu)建的缺血性腦卒中模型（OGD模型）為基礎(chǔ)，對(duì)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞用全培培養(yǎng)基（單純OGD/再灌注組，Standard組）、BMSC-CM（含旁分泌因子，Conditioned組）或采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與BMSCs共培養(yǎng)（Co-cultured組）進(jìn)行干預(yù)，以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的OGD/再灌注損傷。OGD6h，再灌注24h后，CCK8檢測(cè)損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性，TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)凋亡相

6、關(guān)蛋白Bax、Bcl2和Caspase3的蛋白表達(dá);免疫熒光檢測(cè)損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP骨架蛋白表達(dá)，并觀察腫大細(xì)胞數(shù)變化，Western blot檢測(cè)GFAP蛋白表達(dá)情況。為進(jìn)一步研究相關(guān)分子機(jī)制，p38 MAPK和JNK通路的抑制劑和激活劑，以及p38 MAPK和JNK下游通路p53和STAT1的抑制劑對(duì)上述模型加以干預(yù)，干預(yù)后采用同樣方式檢測(cè)損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活和反應(yīng)性增生情況。
　　結(jié)果：以下各組，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義(p＜0.05) BMSCs及BMSC-CM（含旁分泌因子）均能夠增加OGD/再灌注后損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性(p＜0.05);減少細(xì)胞的凋亡(p＜0.05);抑制促凋亡蛋白Bax(p＜0.05)和Caspase3(p＜0.05)，促進(jìn)抑凋亡蛋白Bcl2的蛋白表達(dá)(p＜0.05)，與單純OGD/再灌注組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。另外，旁分泌因子還能減少腫大的星形膠質(zhì)細(xì)胞個(gè)數(shù)，并能顯著下調(diào)GFAP的過(guò)表達(dá)(p＜0.05)

8、。BMSCs及BMSC-CM干預(yù)后，單純OGD/再灌注激活的p38 MAPK和JNK及其下游通路p53和STAT1均被抑制，p-p38、p-JNK、p-p53、p53和p-STAT1蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(p＜0.05)。與單純OGD/再灌注組相比，p38 MAPK和JNK信號(hào)通路抑制劑，能夠顯著增加損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性(p＜0.05)，減少細(xì)胞的凋亡(p＜0.05);抑制促凋亡蛋白Bax(p＜0.05)和Caspase3(p＜0.05)

9、，促進(jìn)抑凋亡蛋白Bcl2的蛋白表達(dá)(p＜0.05);并能顯著下調(diào)GFAP的過(guò)表達(dá)(p＜0.05)。單純OGD/再灌注損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞被p38 MAPK和JNK激動(dòng)劑干預(yù)后，損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性顯著下降(p＜0.05)，凋亡數(shù)增加，促凋亡蛋白Bax和Caspase3表達(dá)量增加(p＜0.05)，抑凋亡蛋白Bcl2表達(dá)量下降(p＜0.05)，并增加了GFAP的表達(dá)(p＜0.05);BMSC-CM加入p38 MAPK和JNK激動(dòng)劑后，旁分泌

10、因子對(duì)損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的改善，細(xì)胞凋亡數(shù)和Bax，Caspase3，GFAP蛋白表達(dá)的抑制，Bcl2表達(dá)的促進(jìn)作用均受到抑制(p＜0.05)。另外，與單純OGD/再灌注組相比，p53和STAT1信號(hào)通路抑制劑，能夠顯著增加損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性(p＜0.05)，減少細(xì)胞的凋亡(p＜0.05);抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase3，促進(jìn)抑凋亡蛋白Bcl2的蛋白表達(dá)(p＜0.05);STAT1能顯著下調(diào)GFAP的過(guò)表達(dá)(p＜0.05)

11、，p53則無(wú)此效果(p＞0.05)。
　　結(jié)論：BMSCs旁分泌因子通過(guò)抑制p38 MAPK和JNK信號(hào)通路，進(jìn)而保護(hù)OGD/再灌注后損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞，減少細(xì)胞凋亡并抑制GFAP的過(guò)表達(dá)，且p38 MAPK和JNK信號(hào)通路的下游分子p53與STAT1也參與了該過(guò)程。因此，BMSCs旁分泌因子對(duì)缺血性腦卒中后損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的藥理學(xué)作用是缺血性腦卒中治療的有效方式之一，其中p38 MAPK和JNK信號(hào)通路將會(huì)是潛在有效的治療靶點(diǎn)。

12、
　　第三章 BMSCs旁分泌因子對(duì)OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞其它生物學(xué)功能的影響
　　目的：初步探討B(tài)MSCs旁分泌因子對(duì)OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌、水通道蛋白以及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響。
　　方法：以體外構(gòu)建的缺血性腦卒中模型（OGD模型）為基礎(chǔ)，對(duì)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞用全培培養(yǎng)基（單純OGD/再灌注組，Standard組）、BMSC-CM（含旁分泌因子，Condit

13、ioned組）或采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與BMSCs共培養(yǎng)（Co-cultured組）進(jìn)行干預(yù)，以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的OGD/再灌注損傷。OGD6h，再灌注24h后，DCFH-DA檢測(cè)ROS的產(chǎn)生，qPCR檢測(cè)免疫調(diào)節(jié)蛋白和炎癥因子（COX2，iNOS，TLR4，IL-6，IL-1β，TNF-α和IL-10），神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(VEGF，BDNF和bFGF)，水通道蛋白(AQP4)以及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（EAAT1和EAAT2）的mRNA表

14、達(dá)情況。
　　結(jié)果：以下各組，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。BMSCs及BMSC-CM（含旁分泌因子）均能夠減少ROS的產(chǎn)生，抑制免疫調(diào)節(jié)蛋白和促炎因子COX2，iNOS，TLR4，IL-6，IL-1β，TNF-α的mRNA表達(dá)，促進(jìn)抑炎因子IL-10和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子VEGF，BDNF，bFGF的mRNA表達(dá)，并抑制水通道蛋白AQP4的mRNA上調(diào)和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT1，EAAT2的mRNA下調(diào)，與單純OGD/再灌注比

15、，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論：BMSCs旁分泌因子能夠抑制OGD/再灌注后損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生;并能抑制OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)，減少促炎的免疫調(diào)節(jié)蛋白和免疫反應(yīng)因子的表達(dá)(IL-6，IL-1β，TNF-α，COX2，iNOS和TLR4)，同時(shí)也增加促炎因子IL-10的表達(dá);促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子VEGF，BDNF和bFGF的表達(dá);抑制OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的過(guò)表達(dá)，