血紅素氧化酶1對脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、凋亡、成骨活性和募集能力的影響.pdf

1、目的：從大鼠腹股溝脂肪中提取培養(yǎng)脂肪基質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived stromal cells, ADSCs），鑒定其生物學(xué)特性；構(gòu)建高表達(dá)血紅素氧化酶1（Heme oxygenase1, HO-1）的慢病毒表達(dá)載體，包裝病毒后轉(zhuǎn)染ADSCs，建立ADSCs-HO-1模型；體外研究HO-1修飾的ADSCs對其自身增值、凋亡和成骨分化的影響，以及對周圍細(xì)胞的募集作用，并探討其在骨組織工程中的應(yīng)用策略。
　　方法：1.膠原

2、酶消化脂肪獲取細(xì)胞后，采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法分離培養(yǎng) ADSCs，接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)傳代。通過觀測其形態(tài)特點(diǎn)、流式細(xì)胞技術(shù)鑒定其表面標(biāo)志和多功能分化潛能（成脂分化和成骨分化）鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為脂肪基質(zhì)干細(xì)胞；2.從攜帶有目的基因 HO-1的載體 Puc57上克隆目的基因序列，通過酶切、酶連，將其連入慢病毒表達(dá)載體pZsG中，再將連接成功的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5α，經(jīng)菌落 PCR鑒定連接結(jié)果，擴(kuò)增提取該表達(dá)載體。將攜帶

3、目的基因的慢病毒表達(dá)載體與另外三個(gè)慢病毒包裝載體在293T細(xì)胞中包裝，分別于48h和72h收集慢病毒液。在8μg/ml的轉(zhuǎn)染試劑Polybrene條件下轉(zhuǎn)染ADSCs，建立ADSCs-HO-1模型，western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染結(jié)果；3.將細(xì)胞分為四組：ADSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)HO-1組（A組）、ADSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)空載體組（B組）、ADSCs未轉(zhuǎn)導(dǎo)組（C組）和ADSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)HO-1組加錫-原卟啉(Sn-protoporphyrin, SnPP)（D

4、組）。采用MTT、流式細(xì)胞儀分析凋亡率探討HO-1修飾的ADSCs對其自身增值、凋亡和成骨分化的影響；通過qRT-PCR檢測骨標(biāo)志物和鈣基質(zhì)染色分析HO-1修飾的ADSCs對其自身成骨分化情況；劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell觀察HO-1高表達(dá)對ADSCs募集作用的影響。
　　結(jié)果：1.體外成功分離培養(yǎng)出大鼠 ADSCs，形態(tài)呈長梭形，具有成骨、成脂分化潛能，經(jīng)鑒定第2代貼壁細(xì)胞陽性表達(dá)CD29（99.3％）、CD44（70.7%）、

5、CD90（52.0%），陰性表達(dá)CD45（3.73%）和CD31（6.58%）；
　　2.構(gòu)建高表達(dá)HO-1的慢病毒表達(dá)載體pZsG-HO-1，菌落PCR證實(shí)HO-1片段連入表達(dá)載體，包裝慢病毒后轉(zhuǎn)染ADSCs，western blot檢測HO-1蛋白在ADSCs中高表達(dá)；
　　3.①M(fèi)TT連續(xù)1周檢測A和B組細(xì)胞活性，第2天測定A組較B組活性增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）且持續(xù)一周；②流式分析細(xì)胞凋亡率顯示，A組細(xì)

6、胞凋亡率為41.3%±3.34%，較B組（58.7%±4.25%）和C組（55.3%±4.50%）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），且SnPP可增加A組細(xì)胞的凋亡率（70.7%±4.01%）；③qRT-PCR測得細(xì)胞成骨分化第7天時(shí)， ALP和Runx2升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），ColⅠ和OCN未見明顯差異；第14天時(shí)， ALP、Runx2、ColⅠ和OCN均較第7天升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；第21

7、天時(shí)，茜素紅和von kossa均證實(shí)，HO-1高表達(dá)可提高ADSCs鈣結(jié)節(jié)形成。④劃痕實(shí)驗(yàn)顯示A組細(xì)胞遷移率69.3%±3.8%，較B組（31.5%±8.4%）和C組（32.8%±8.6%）明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，A組上清可增加細(xì)胞遷移的數(shù)量，且這種效應(yīng)可被HO-1活性抑制劑SnPP抑制。
　　結(jié)論：1.密度梯度離心聯(lián)合貼壁方法簡單、可以大量體外擴(kuò)增 ADSCs，具有多向分化潛能，