間充質(zhì)干細(xì)胞上清液對(duì)2,5-己二酮致PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:觀察間充質(zhì)干細(xì)胞上清液(MSC-CM)對(duì)2，5-己二酮(HD)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。
　　材料和方法:體外培養(yǎng)、純化Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，并收集其第5代MSC-CM。將實(shí)驗(yàn)分為四組:①空白對(duì)照組:不對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行任何處理。②MSC-CM對(duì)照組:向PC12培養(yǎng)體系中加入40％的MSC-CM。③HD暴露組:PC12細(xì)胞暴露于20 mmol/L HD24 h，制備PC12細(xì)

2、胞損傷模型。④MSC-CM保護(hù)組:20 mmol/L HD作用于PC12細(xì)胞24 h后，分別加入10％、20％、40％體積的MSC-CM。以上各組用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性;Hoechst33342觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;Real-time RT-PCR檢測(cè)Bax、Bcl-2和BMSCs中NGF的表達(dá);Westem-Blotting檢測(cè)Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素C(cytochromec)以及BMSCs中NGF蛋

3、白表達(dá)量;rhodamine123法檢測(cè)線粒體膜電位(MMP)的變化;Bradford法檢測(cè)待測(cè)樣品單位蛋白中caspase-3活性;ELISA法對(duì)3-6代MSC-CM中NGF含量進(jìn)行測(cè)定。
　　結(jié)果:1.MTT結(jié)果與空白對(duì)照組比較，MSC-CM對(duì)照組PC12細(xì)胞的活性無顯著差異(p＞0.05)，而HD暴露組的PC12細(xì)胞活性顯著降低(p＜0.05)。MSC-CM保護(hù)組與HD暴露組相比，PC12細(xì)胞活性明顯提高(p＜0.05)，且

4、呈劑量反應(yīng)關(guān)系。2.細(xì)胞凋亡結(jié)果Hoechst33342觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)改變，對(duì)照組細(xì)胞核核質(zhì)均勻細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，HD暴露組細(xì)胞呈新月形，核仁消失，染色質(zhì)聚集移動(dòng)，有特征性凋亡小體形成，而MSC-CM保護(hù)組PC12細(xì)胞特征性凋亡小體細(xì)胞有所減少;AV/PI雙染流式細(xì)胞儀對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行凋亡率的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，HD暴露組PC12細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組顯著增加(p＜0.05)，加入MSC-CM后PC12細(xì)胞凋亡率逐漸降低。3.Bax、Bc

5、l-2的mRNA表達(dá)結(jié)果HD暴露組中，PC12細(xì)胞Bax的mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(p＜0.05)，而加入MSC-CM后Bax的mRNA表達(dá)較HD暴露組明顯降低(p＜0.05)，并且隨著MSC-CM體積的增加而降低;PC12細(xì)胞Bcl-2的mRNA表達(dá)，HD暴露組較對(duì)照組明顯降低(p＜0.05)，而MSC-CM保護(hù)組mRNA表達(dá)明顯高于HD暴露組(p＜0.05); Bax與Bcl-2 mRNA的比值，HD暴露組與空白對(duì)照組相比，比值明

6、顯增加(p＜0.05)，而MSC-CM保護(hù)組較HD暴露組比值降低(p＜0.05)。4.Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)結(jié)果HD暴露組PC12細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組(p＜0.05)，而MSC-CM組Bax的蛋白表達(dá)較HD暴露組有所降低(p＜0.05)，并且隨著MSC-CM體積的增加而減少;PC12細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)，HD暴露組中明顯低于空白對(duì)照組(p＜0.05)，MSC-CM保護(hù)組明顯高于HD暴露組(p＜0.05)，且隨著

7、MSC-CM體積分?jǐn)?shù)的增加而增加;Bax與Bcl-2的比值Bax/Bcl-2，HD暴露組與空白對(duì)照組相比，其比值明顯增加(p＜0.05)，MSC-CM保護(hù)組較HD暴露組比值降低(p＜0.05)。5.MMP的檢測(cè)結(jié)果HD暴露組PC12細(xì)胞較空白對(duì)照組相比其線粒體膜電位顯著降低(p＜0.05)，MSC-CM保護(hù)組較HD暴露組逐漸增加，膜電位值由24.28％上升到38.15％、51.45％和66.47％。6.Cytochrome c的West

8、ern-Blotting結(jié)果線粒體內(nèi)cytochrome c蛋白表達(dá)，HD暴露組較空白對(duì)照組顯著降低(p＜0.05)，MSC-CM保護(hù)組與HD暴露組相比cytochrome c的蛋白表達(dá)明顯上升(p＜0.05);另一方面在胞漿中cytochromec的蛋白表達(dá)情況與在線粒體中相反。7.Caspase-3活性的檢測(cè)結(jié)果HD暴露組與對(duì)照組相比，PC12細(xì)胞caspase-3的活性顯著增加(p＜0.05)，而MSC-CM保護(hù)組與HD暴露組相比

9、活性降低(p＜0.05)。8.NGF水平的檢測(cè)結(jié)果BMSCs中NGF的mRNA在3到6代中均有所表達(dá)，而在第3代mRNA的表達(dá)量最高;蛋白表達(dá)量與Real-time RT-PCR結(jié)果相似;ELISA法測(cè)3到6代MSC-CM中NGF的含量根據(jù)相對(duì)曲線算出的MSC-CM中NGF相對(duì)值分別為52.41，49.17，24.11和23.38pg/ml。
　　結(jié)論:HD誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡;MSC-CM對(duì)HD誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用;