七氟醚及右美托咪定對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元發(fā)育的影響及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分培養(yǎng)新生SD原代大鼠海馬神經(jīng)元、觀察其形態(tài)學(xué)改變及純度鑒定
　　目的：掌握新生 SD大鼠海馬神經(jīng)元的體外培養(yǎng)技術(shù)；觀察新生原代大鼠 SD海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變；采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法鑒定神經(jīng)元純度。
　　方法：取新生24 h內(nèi)的SD乳鼠，用碘酊和75％乙醇消毒，剪斷頭，分層剪開大鼠頭部的皮膚和打開顱骨，用彎鑷取出其整個(gè)大腦，置于預(yù)先冷卻的 DMEM液中，找到并剝離兩側(cè)完整的海馬組織，置于解剖顯微鏡下，剝離并去除海馬

2、表面的血管和被膜，移入加有木瓜酶的DMEM中，溫度為37℃，置于5%CO2培養(yǎng)箱中，消化30分鐘。置入含有10%血清的 DMEM液中2分鐘，終止組織消化。在含有血清的DMEM液中，用維納斯剪剪碎消化完成的組織塊，反復(fù)輕輕吹打三到五次，置入200目細(xì)胞篩，過篩。取0.9 ml篩過的組織液,采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法，計(jì)量活細(xì)胞數(shù)，將配制成1×106/ml密度的細(xì)胞懸液,每孔加500μl，種植于 Matrigel基膜包被的24孔培養(yǎng)板上，置于恒溫37

3、℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h。全量更換成無血清Neurobasal培養(yǎng)基。于培養(yǎng)的第48 h時(shí)，加入終濃度為10μmol/L的阿糖胞苷。此后每2天半量更換培養(yǎng)液，密切觀察神經(jīng)元的生長狀態(tài)。于培養(yǎng)7天后，應(yīng)用免疫熒光化學(xué)技術(shù)，按不同的熒光標(biāo)記得情況，可以分清神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。應(yīng)用熒光顯微鏡觀察神經(jīng)元的狀況并鏡下留取照片，用于計(jì)數(shù)。按照隨機(jī)原則，分別選取3個(gè)孔的隨機(jī)3個(gè)視野，高倍視野(10×20倍)下，對(duì)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及所有

4、細(xì)胞核進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過計(jì)算神經(jīng)元所占的百分比的均值，作為每孔神經(jīng)元純度。
　　結(jié)果：體外培養(yǎng)的新生原代 SD大鼠海馬神經(jīng)元，形態(tài)典型，突起連接成網(wǎng)，生長狀態(tài)良好；體外培養(yǎng)的新生原代 SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞核染色清晰，海馬神經(jīng)元純度為(94.81±1.90)%，各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.81）。
　　結(jié)論：體外培養(yǎng)的原代 SD新生乳鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)典型，純度在90%以上，能夠滿足進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)要求。
　　第二部分七氟醚

5、對(duì)發(fā)育期海馬神經(jīng)元的影響
　　目的：探討七氟醚對(duì)原代培養(yǎng)的發(fā)育期6d的SD乳鼠海馬神經(jīng)元影響
　　方法：取原代培養(yǎng)第6d的海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(C組)七氟醚組隨機(jī)分成3組,分別供應(yīng)對(duì)照組空氣，1MAC七氟醚3h、6h、12h的七氟醚處理（F1組、F2組、F3組）。所有海馬神經(jīng)元繼續(xù)培養(yǎng)12h后，為各組神經(jīng)元全量換液，并用PBS清洗2次，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，隨機(jī)選取視野為神經(jīng)元拍照。所得照片用Motic Me

6、d6.0軟件處理，使用其測(cè)量長度工具測(cè)量視野內(nèi)軸突和樹突的總長度，計(jì)數(shù)該視野神經(jīng)元總數(shù)，以該視野神經(jīng)元平均突起總長度作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。用免疫熒光化學(xué)法測(cè)定各組神經(jīng)元突觸素的含量，采集突觸素?zé)晒鈭D像，用Image-Pro Plus6.0軟件分析各組突觸素的平均熒光密度（ MOD， mean optical density）。用流式細(xì)胞檢測(cè)檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元的凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1MAC七氟醚暴露3小時(shí)（F1組）同

7、對(duì)照組（C組），神經(jīng)元平均突起總長度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；F2組及F3組與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；F2組和F3與F1組比較，數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　F2組及 F3組與 C組比較，數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；F1組與C組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；F2組和F3與F1組比較，數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　1MAC七氟醚暴露3小時(shí)

8、（F1組）較對(duì)照組（C組），神經(jīng)元凋亡率無明顯差別，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;隨著1MAC七氟醚暴露的時(shí)間延長及 F2和 F3組，神經(jīng)元凋亡率逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;F2和F3組與C組和F1組比較，F(xiàn)2組和F3組神經(jīng)元凋亡率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：1MAC七氟醚暴露6小時(shí)及以上影響原代培養(yǎng)的乳鼠海馬神經(jīng)元突起及突觸的發(fā)育，引起海馬神經(jīng)元的凋亡增加，可能引起乳鼠成年后學(xué)習(xí)和記憶功能

9、的降低。
　　第三部分七氟醚對(duì)發(fā)育期海馬神經(jīng)元影響的可能機(jī)制
　　目的：探討七氟醚對(duì)發(fā)育期海馬神經(jīng)元影響的可能機(jī)制。
　　方法：取原代培養(yǎng)第6d的海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組(C組)、1MAC七氟醚3小時(shí)組（F1組）、1MAC七氟醚6小時(shí)組(F2組)、1MAC七氟醚12小時(shí)(F3組)。F1、F2、F3組分別暴露于1MAC七氟醚下； C組暴露于空氣下。將海馬神經(jīng)元置于恒溫水浴箱中，保持溫度于37℃，應(yīng)用DRAGE

10、R麻醉機(jī)，給于6L/min的氣體流量，1Mac的七氟醚混合95%的空氣和5%的CO2，連接已預(yù)先制備的玻璃容器內(nèi)，應(yīng)用七氟醚氣體檢測(cè)儀檢測(cè)氣體濃度，維持七氟醚在容器內(nèi)為1MAC。對(duì)照組置于玻璃器皿內(nèi)給于除七氟醚以外的氣體。12小時(shí)后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。Western blot檢測(cè)各組BDNF和TrkB蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：BDNF水平在暴露于1MAC七氟醚6小時(shí)（F2組）、12小時(shí)（F3組）較對(duì)照組（C組）圖像可見有明顯的降低，

11、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而暴露于1MAC七氟醚3小時(shí)（F1組）BDNF水平較對(duì)照組（C組）圖像可見有明顯的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。BDNF灰度值水平,在暴露于1MAC七氟醚6小時(shí)（F2組）、12小時(shí)（F3組）較對(duì)照組（C組）有明顯的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而暴露于1MAC七氟醚3小時(shí)（F1組）BDNF水平較對(duì)照組（C組）有明顯的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C組和F1組、F2組、F3組

12、內(nèi)參β-actin條帶灰度值，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　TrkB水平在暴露于1MAC七氟醚6小時(shí)（F2組）、12小時(shí)（F3組）較對(duì)照組（C組）圖像可見有明顯的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而暴露于1MAC七氟醚3小時(shí)（F1組）TrkB水平較對(duì)照組（C組）圖像可見有明顯的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TrkB灰度值水平在暴露于1MAC七氟醚6小時(shí)（F2組）、12小時(shí)（F3組）較對(duì)照組（C組）有明顯的

13、降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而暴露于1MAC七氟醚3小時(shí)（F1組）TrkB水平較對(duì)照組（C組）有明顯的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C組和F1組、F2組、F3組內(nèi)參β-actin條帶灰度值，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　11MAC七氟醚暴露3小時(shí)增加了體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元 BDNF和TrkB表達(dá)但未引起海馬神經(jīng)元凋亡、突起和突觸發(fā)育的改變。
　　21MAC七氟醚暴露時(shí)間6小時(shí)減

14、少體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元BDNF和TrkB表達(dá)可能是七氟醚響海馬神經(jīng)元突起及突觸發(fā)育和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制之一。
　　3七氟醚對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的影響具有雙向性，可能與七氟醚暴露的時(shí)間有關(guān)，其機(jī)制可能與七氟醚引起的BDNF和TrkB表達(dá)的改變相關(guān)。
　　第四部分右美托咪定對(duì)七氟醚引起的發(fā)育期海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性的影響
　　目的：探討右美托咪定對(duì)七氟醚引起的發(fā)育期海馬神經(jīng)元毒性的影響。
　　方法：取原代培養(yǎng)第6d

15、的海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組(C組)、1MAC七氟醚組（F組）、右美托咪定組(D組)、1MAC七氟醚加右美托咪定組(FD組)、育亨賓組（Y組）。FD組分成FD1組給于右美托咪定0.1 umol/L;FD2組給于右美托咪定1 umol/L;FD3組給于右美托咪定10 umol/L。Y組分成：Y1組，Y2組，Y3組分別給予右美托咪定0.1 umol/L,1 umol/L,10 umol/L。F組、FD組和Y組分別暴露于1MAC七氟

16、醚下6小時(shí)；D組加入生理鹽水稀釋的右美托咪定，使其終濃度為100 nmol/L，F(xiàn)D組采取1MAC七氟醚混合95%的空氣和5%的CO2,6h同時(shí)加入生理鹽水稀釋的右美托咪定，使其終濃度為100nmol/L，C組和D組采用95%的空氣和5%的CO2，Y組先加入育亨賓，使其終濃度為2umol/L，再加入右美托咪定和七氟醚，終濃度同F(xiàn)D組，F(xiàn)組和C組加入等體積的生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)12h后，為各組神經(jīng)元全量換液，并用PBS清洗2次，加入培養(yǎng)基繼

17、續(xù)培養(yǎng)24h，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，收集每組細(xì)胞，利用Western Blot技術(shù)分析各組腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF，brain-derived neurotrophic factor)及其特異性受體TrkB和坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2（CRMP-2，collapsin response mediator protein-2）表達(dá)的改變。利用 Gel Image Analysis V2.02軟件分析各條帶的灰度值， BDNF，TrkB

18、和CRMP-2蛋白的相對(duì)量分別以BDNF，TrkB和CRMP-2條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示。用流式細(xì)胞檢測(cè)檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元的凋亡情況。
　　結(jié)果：1比較各組BDNF，TrkB和CRMP-2蛋白的表達(dá)
　?。?）BDNF：BDNF的表達(dá)水平，1MAC七氟醚暴露6小時(shí)（F組）及同時(shí)給于濃度為0.1 umol/L、1umol/L、10 umol/L右美托咪定（FD組）和Y組比對(duì)照組（C組），數(shù)

19、值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單純右美托咪定組和對(duì)照組之間表達(dá)無明顯差別，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;而復(fù)合1MAC七氟醚和三種劑量右美托咪定均較單純1MAC七氟醚暴露，BDNF表達(dá)水平有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；FD1組較FD2組和FD3組,BDNF表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）,FD2組與FD3組間表達(dá)無明顯差別（P>0.05）;復(fù)合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨賓時(shí)，BDNF的表達(dá)水平較單

20、純1MAC七氟醚，數(shù)值有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;復(fù)合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨賓時(shí)，BDNF的表達(dá)水平較 FD組，數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）而當(dāng)給于不同劑量的右美托咪定的 Y1組、Y2組和 Y3組間,BDNF表達(dá)無明顯差別。
　?。?）TrkB：TrkB的表達(dá)水平，1MAC七氟醚暴露6小時(shí)（F組）及同時(shí)給于濃度為0.1 umol/L、1umol/L、10 umol/L右美托咪定（FD組）

21、和Y組比對(duì)照組（C組），數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單純右美托咪定組和對(duì)照組之間表達(dá)無明顯差別，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;而復(fù)合1MAC七氟醚和三種劑量右美托咪定均較單純1MAC七氟醚暴露，TrkB表達(dá)水平有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；FD1組較FD2組和FD3組,TrkB表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）,FD2組與FD3組間表達(dá)無明顯差別（P>0.05）;復(fù)合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨賓

22、時(shí)， TrkB的表達(dá)水平較單純1MAC七氟醚，無明顯差異（P>0.05）;復(fù)合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨賓時(shí)，TrkB的表達(dá)水平較 FD組，數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）而當(dāng)給于不同劑量的右美托咪定的Y1組、Y2組和Y3組間,TrkB表達(dá)無明顯差別（P>0.05）。
　　（3）CRMP-2:1MAC七氟醚暴露6小時(shí)（F組）及同時(shí)給于濃度為0.1 umol/L、1umol/L、10 umol/L右美托咪定（FD

23、組）和Y組比對(duì)照組（C組），數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單純右美托咪定組和對(duì)照組之間表達(dá)無明顯差別，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;而復(fù)合1MAC七氟醚和三種劑量右美托咪定均較單純1MAC七氟醚暴露，CRMP-2表達(dá)水平有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；FD1組較FD2組和FD3組,CRMP-2表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）,FD2組與FD3組間表達(dá)無明顯差別（P>0.05）;復(fù)合1MAC七氟醚、右美托

24、咪定和育亨賓時(shí)，CRMP-2的表達(dá)水平較單純1MAC七氟醚，數(shù)值有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;復(fù)合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨賓時(shí)， CRMP-2的表達(dá)水平較 FD組，數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）而當(dāng)給于不同劑量的右美托咪定的 Y1組、Y2組和 Y3組間,CRMP-2表達(dá)無明顯差別（P>0.05）。
　　2比較各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況。
　　1MAC七氟醚暴露6小時(shí)（F組）及同時(shí)給于濃

25、度為三種劑量的右美托咪定（FD組）和復(fù)合育亨賓的Y組均較對(duì)照組（C組），神經(jīng)元凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單純右美托咪定組和對(duì)照組之間表達(dá)無明顯差別，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而復(fù)合1MAC七氟醚和右美托咪定較單純1MAC七氟醚暴露，神經(jīng)元凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,其中FD1組較FD2組和FD3組,神經(jīng)元凋亡率明顯增高復(fù)合（ P<0.05）而 FD2組與 FD3組間無明顯差異（P>0

26、.05）;1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨賓時(shí)，神經(jīng)元凋亡率較單純1MAC七氟醚，數(shù)值有所降低，較單純復(fù)合右美托咪定組,凋亡率明顯增高（P<0.05）;而給于不同劑量的右美托咪定復(fù)合七氟醚,育亨賓,Y1組、Y2組和Y3組間無明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　11MAC七氟醚減少體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元BDNF，TrkB和CRMP-2的表達(dá)可能是七氟醚影響海馬神經(jīng)元突起及突觸發(fā)育的分子機(jī)制之一；
　　2右美托咪定使七