炙甘草湯調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細胞參與造血的理論和實驗研究.pdf

1、目的：
　　通過實驗研究炙甘草湯對培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞造血因子分泌、細胞表面受體表達及給藥后相應細胞培養(yǎng)上清液對造血祖細胞增殖的影響，探討“補心方劑”炙甘草湯在造血相關(guān)過程的參與程度，為難治性血液疾病的治療提供新的思路。
　　方法：
　?。?）體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞株（EA.hy926），選取炙甘草湯及右歸飲兩個方劑進行實驗，設(shè)置炙甘草湯組、右歸飲組、混合組（炙甘草湯+右歸飲）及空白對照組，在給藥后第3、6、9天分別收取

2、細胞培養(yǎng)上清，利用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的分泌情況。
　?。?）體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞株（EA.hy926），選取炙甘草湯與右歸飲兩個方劑進行實驗，設(shè)置炙甘草湯組、右歸飲組、混合組（炙甘草湯+右歸飲）及空白對照組，在給藥后利用免疫組化方法檢測細胞表面細胞因子受體表達情況。
　?。?）體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞株（EA.hy926），選取炙甘草湯與右歸飲兩個方劑進行實驗，設(shè)置炙甘草湯組、右歸飲組、混合組（炙甘草湯

3、+右歸飲）及空白對照組，收集細胞培養(yǎng)上清液；分離人臍帶血單個核細胞，將收集的細胞培養(yǎng)上清液及相應中醫(yī)湯劑分別加入培養(yǎng)體系中，觀察HPP-CFC、BFU-E集落形成情況。
　　結(jié)果：
　　1．炙甘草湯對臍靜脈內(nèi)皮細胞造血因子分泌的影響：
　　（1）TGF-β1分泌：給藥組均明顯刺激臍靜脈內(nèi)皮細胞產(chǎn)生TGF-β1，與空白對照組相比差異顯著（P<0.001）。實驗初期（第3、6天）炙甘草湯刺激效果較強，實驗后期（第9天）混合

4、給藥組表現(xiàn)出更好的刺激效果。
　?。?）G-CSF分泌：給藥組均明顯刺激臍靜脈內(nèi)皮細胞產(chǎn)生G-CSF，與空白對照組相比差異顯著（P<0.001）?；旌辖o藥組刺激效果最明顯，其次為炙甘草湯組。給藥后細胞因子分泌均隨時間延長而增加。
　?。?) TPO分泌：第6天，炙甘草湯明顯刺激臍靜脈內(nèi)皮細胞產(chǎn)生TPO，與空白對照相比差異顯著（p<0.001）；第9天，炙甘草湯單獨作用以及兩種中藥聯(lián)合使用時TPO的產(chǎn)生與對照相比也有明顯差異。

5、
　?。?) EPO分泌：第6天與第9天，右歸飲作用時能夠刺激臍靜脈內(nèi)皮細胞產(chǎn)生EPO，但炙甘草湯單獨作用以及兩種中藥聯(lián)合使用時卻不能明顯刺激細胞產(chǎn)生EPO。
　?。?）IGF-1分泌：在整個實驗周期內(nèi)，給藥組與對照組 IGF-1分泌水平相同，沒有明顯差異。6）中藥給藥組及對照組均未檢測到GM-CSF、IL-3、SCF、VEGF的分泌。
　　2．炙甘草湯對臍靜脈內(nèi)皮細胞表面細胞因子受體影響：
　?。?）EPO-R

6、表達：三個給藥組均能刺激 EPO-R表達上調(diào)，但僅以右歸飲組刺激效果最明顯（與空白對照組相比P<0.05）；
　?。?）FLT3表達：中藥刺激后給藥組均下調(diào)FLT3表達，其中以炙甘草湯組為最明顯（與空白對照組相比P<0.001）。
　　（3）GM-CSF受體表達：混合用藥時下調(diào)作用最明顯（與空白對照組相比P<0.01），其次是炙甘草湯組（與空白對照組相比P<0.05）；
　?。?）G-CSF受體表達：兩個中藥方劑均能明

7、顯引起受體下調(diào)表達，其中右歸飲下調(diào)效果最明顯（與空白對照組相比P<0.001）。
　　3.炙甘草湯細胞培養(yǎng)上清對造血祖細胞集落形成的影響：
　?。?）BFU-E形成：細胞培養(yǎng)上清液均能刺激細胞集落形成，其中尤以炙甘草湯組最為明顯，其次是混合組與右歸飲組。在細胞培養(yǎng)上清組中炙甘草湯培養(yǎng)上清組與混合給藥培養(yǎng)上清組兩組與空白細胞上清組相比差異明顯。
　?。?）HPP-CFC形成：單獨添加中藥湯劑并不能明顯刺激HPP-CFC集

8、落形成，各培養(yǎng)上清組均能刺激集落形成增加，炙甘草湯細胞培養(yǎng)上清刺激集落形成效果最明顯，與空白對照組相比P<0.001，其次是右歸飲培養(yǎng)上清與混合中藥培養(yǎng)上清，與空白對照組相比P<0.01。
　　結(jié)論：
　　1.炙甘草湯能促進臍靜脈內(nèi)皮細胞造血相關(guān)細胞因子的分泌，合并右歸飲作用時效果更加明顯。
　　2.炙甘草湯能下調(diào)臍靜脈內(nèi)皮細胞表面部分細胞因子受體的表達，從而增加游離細胞因子的含量。
　　3.炙甘草湯細胞培養(yǎng)上清