基質(zhì)金屬蛋白酶和miR99a在卡波西樣血管內(nèi)皮瘤中作用機制的研究.pdf

1、第一部分基質(zhì)金屬蛋白酶和微小核糖核酸99a在卡波西樣血管內(nèi)皮瘤中表達情況的研究
　　目的：探討卡波西樣血管內(nèi)皮瘤中（ kaposiform haemangioendothelioma， KHE）基質(zhì)金屬蛋白酶（ matrix metalloproteinase，MMP）和微小核糖核酸（micro ribonucleic acid， microRNA）相互作用。
　　方法：收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院2004年至2013年間2

2、9例卡波西樣血管內(nèi)皮瘤病人標本。所有病例均經(jīng)過病理學(xué)及臨床確診。運用免疫組化、逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)、蛋白質(zhì)印記(Western blot)檢測KHE病人標本中MMP3、MMP7、MMP9、MMP13和微小核糖核酸99a（miR99a）的表達，使用雙變量相關(guān)分析分別計算MMPs和miR99a之間的相關(guān)系數(shù)。
　　結(jié)果： KHE標本中通過免疫組化、RT-qPCR、Western blot三種方法檢測到 MMP7

3、、MMP9、MMP13的表達，但沒有檢測出 MMP3的表達。我們發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶7與MiR99a的表達水平有顯著意義的相關(guān)性（r=0.76;P<0.001），基質(zhì)金屬蛋白酶13與MiR99a的表達水平也有顯著意義的相關(guān)性（r=0.81; P<0.001），而基質(zhì)金屬蛋白酶9的水平與MiR99a的表達水平?jīng)]有相關(guān)性（r=0.0052;P=0.96）。
　　結(jié)論：基質(zhì)金屬蛋白酶和微小核糖核酸與卡波西樣血管內(nèi)皮瘤的腫瘤發(fā)生有關(guān)。卡波西

4、樣血管內(nèi)皮瘤中微小核糖核酸99a與基質(zhì)金屬蛋白酶7和基質(zhì)金屬蛋白酶13有密切相關(guān)性，與基質(zhì)金屬蛋白酶9沒有相關(guān)性。
　　第二部分微小核糖核酸99a通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶7和基質(zhì)金屬蛋白酶13控制卡波西樣血管內(nèi)皮瘤的侵襲性的研究
　　目的：進一步探索基質(zhì)金屬蛋白酶7和基質(zhì)金屬蛋白酶13通過微小核糖核酸99a調(diào)節(jié)來控制卡波西樣血管內(nèi)皮瘤的侵襲性的分子機制。
　　方法：使用含20％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)一種人的卡波西

5、樣血管內(nèi)皮瘤的細胞系（SLK）。再分別使用含有過表達的 miR99a的質(zhì)粒和小分子干擾RNA轉(zhuǎn)染SLK細胞，48小時后通過RT-qPCR檢測鑒定miR99a表達情況。通過RT-qPCR、Western blot、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測miR99a高表達（SLK-miR-99a）和低表達的SLK細胞（SLK-ShmiR-99a）基質(zhì)金屬蛋白酶7、基質(zhì)金屬蛋白酶9和基質(zhì)金屬蛋白酶13的表達，利用Transwell細胞體外侵襲實驗觀

6、察miR99a高表達和低表達的SLK細胞侵襲性的變化。在miR99a敲除的SLK細胞（SLK-ShmiR-99a）中分別使用 PI3k/Akt信號通路阻斷劑 LY294002和ERK/MAPK信號通路阻斷劑 PD98059進行干擾，通過RT-qPCR、Western blot、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測miR99a敲除的SLK細胞基質(zhì)金屬蛋白酶7和基質(zhì)金屬蛋白酶13的表達。利用Transwell細胞體外侵襲實驗觀察信號通路阻斷劑

7、LY294002和PD98059對miR99a敲除的SLK細胞侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：通過RT-qPCR檢測證明SLK-miR-99a中miR99a表達明顯高于正常SLK細胞（p<0.05），而SLK-ShmiR-99a中miR99a表達明顯低于正常SLK細胞（p<0.05）。通過RT-qPCR, Western blot和ELISA實驗我們發(fā)現(xiàn)SLK-miR-99a細胞中MMP7和MMP13的表達明顯低于SLK-N細胞（p<

8、0.05），SLK-ShmiR-99a細胞中MMP7和MMP13的表達明顯高于SLK-N細胞（p<0.05），而三種細胞的MMP9表達無明顯差異性（p＞0.05）。通過Transwell細胞體外侵襲實驗發(fā)現(xiàn)SLK-miR-99a實驗組侵襲性明顯小于 SLK-N實驗組（p<0.05），而 SLK-ShmiR-99a實驗組侵襲性明顯強于SLK-N實驗組（p<0.05）。通過RT-qPCR、Western blot和ELISE實驗發(fā)現(xiàn)SLK-

9、ShmiR-99a+ LY294002實驗組SLK細胞MMP7的表達明顯低于SLK-ShmiR-99a細胞（p<0.05），MMP13的表達與 SLK-ShmiR-99a細胞無明顯差異（p＞0.05）；SLK-ShmiR-99a+PD98059實驗組SLK細胞MMP13的表達明顯弱于SLK-ShmiR-99a細胞（p<0.05），MMP7的表達與SLK-ShmiR-99a細胞無明顯差異（p＞0.05）。Transwell細胞體外侵襲實驗

10、發(fā)現(xiàn) SLK-ShmiR-99a+ LY294002和 SLK-ShmiR-99a+ PD98059實驗組 SLK細胞的侵襲能力都弱于SLK-ShmiR-99a（p<0.05），而他們之間比較無顯著性差異（p＞0.05）。
　　結(jié)論：SLK細胞中微小核糖核酸99a通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶7和基質(zhì)金屬蛋白酶13影響KHE的侵襲性，而基質(zhì)金屬蛋白酶9似乎不受微小核糖核酸99a的調(diào)控。PI3k/Akt信號通路的抑制可以顯著消除微小核糖核酸