玻璃體腔移植人臍帶間充質干細胞誘導的神經干細胞對糖尿病大鼠血視網膜屏障保護作用的實驗研究.pdf

1、目的：建立Sprague-Dawley（SD）大鼠糖尿病模型，通過伊文思藍（evans blue， EB）灌注大鼠視網膜后在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中制作透明視網膜標本，直接在普通熒光顯微鏡下觀察早期糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）血視網膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）功能的改變；通過玻璃體腔移植人臍帶間充質干細胞（human

2、 umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）誘導的神經干細胞（neural stem cells，NSCs），觀察其對DR大鼠BRB的影響。
　　方法:（1）40只雄性SD大鼠隨機分為正常對照（CON）組10只大鼠和糖尿病組30只大鼠。腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立糖尿病模型，根據(jù)病程，將糖尿病組大鼠分為糖尿病1個月（DM-1m）組、糖尿病3個月（D

3、M-3m）組及糖尿病6個月（DM-6m）組；CON組大鼠腹腔注射等容量枸櫞酸緩沖液。于各相應時間點經股靜脈按45mg/kg注射30g/L的EB溶液，循環(huán)15min后摘除雙側眼球，立即置于 PBS中完整剝離視網膜，放射狀切開并平鋪于載玻片上，避光晾至完全透明，封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。應用IPP6.0軟件分析圖像，測量并比較EB滲漏區(qū)面積與視網膜面積的百分比。（2）60只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、DR模型對照組及NSCs治療

4、組，其中正常對照組12只大鼠，DR模型對照組及NSCs治療組各24只大鼠。DR模型對照組和NSCs治療組大鼠腹腔注射STZ建立糖尿病模型。于糖尿病成模后3個月，NSCs治療組大鼠右眼玻璃體腔注射2μl NSCs懸液（2×104/μl）；DR模型對照組大鼠右眼注射等容量 PBS；上述兩組大鼠左眼及正常對照組大鼠雙眼不給予任何干預。干預1個月后，采用EB灌注血管視網膜鋪片觀察視網膜血管形態(tài)及滲漏情況；EB定量檢測BRB破壞情況；病理學切片觀

5、察視網膜組織改變情況。
　　結果:（1）糖尿病組大鼠較CON組血糖明顯升高，體重明顯下降（均P＜0.05）。CON組大鼠視網膜血管形態(tài)和走形正常，紅色熒光均勻充盈于血管腔。糖尿病成模1個月時，大鼠視網膜背景熒光較CON組略有增強；3個月時，背景熒光進一步增強，視網膜血管呈節(jié)段性擴張，可見明顯的紅色高熒光區(qū)；6個月時，視網膜血管粗細不均，部分走行迂曲，可見片狀低灌注區(qū)及大量高熒光區(qū)。CON、DM-1m、DM-3m、DM-6m組 EB

6、滲漏區(qū)面積百分比分別為（0.05±0.02）％、（0.27±0.06）%、（1.17±0.18）%及（4.77±0.66）%，總體比較差異有統(tǒng)計學意義（F=795.800，P＜0.000），其中DM-3m、6m組均明顯高于CON組（q’=10.338， q’=43.475；均P＜0.000）。（2）NSCs治療組血糖較正常對照組明顯升高、體重明顯下降（P＜0.05），與DR模型對照組無明顯差異。EB灌注視網膜鋪片檢查顯示，正常對照組大鼠

7、視網膜血管無明顯異常，無EB滲漏到血管外；DR模型對照組背景熒光增強，可見明顯的EB滲漏高熒光區(qū)；NSCs治療組背景熒光略增強，EB滲漏區(qū)較DR模型組明顯減少。EB滲漏定量分析顯示，DR模型對照組大鼠視網膜平均EB滲漏量較正常對照組增加（P＜0.05）；NSCs治療組較DR模型對照組明顯減少（P＜0.05）。視網膜組織病理學檢查示正常對照組視網膜各層結構清晰、排列整齊、形態(tài)正常；DR模型對照組視網膜細胞排列較紊亂，神經纖維層高度水腫，細

8、胞核腫脹、體積增大，細胞密度降低；NSCs治療組視網膜細胞較DR模型對照組略整齊，神經纖維層水腫明顯減輕。
　　結論:（1）EB灌注大鼠視網膜后在PBS中制作透明視網膜標本的方法，可在普通熒光顯微鏡下獲得清晰的大鼠視網膜熒光顯微鏡像；（2）STZ誘導的糖尿病大鼠模型成模3個月時可作為早期DR模型用于實驗研究；（3）通過玻璃體腔移植hUCMSCs誘導的NSCs，能夠改善BRB功能，減少早期DR大鼠血管滲漏，從而達到防治DR進展的治療