小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及純化及其對(duì)環(huán)磷酰胺引起的急性腎損傷的修復(fù)作用.pdf

1、目的：
　　1.分離并大量培養(yǎng)能夠穩(wěn)定傳代的小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs)，對(duì)其生物學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行描述及鑒定；
　　2.應(yīng)用差速貼壁法對(duì)所培養(yǎng)的小鼠ADSCs進(jìn)行純化，獲得高純度的ADSCs；
　　3.探究ADSCs對(duì)環(huán)磷酰胺引起的急性腎損傷的修復(fù)作用。
　　方法：
　　1.在無菌環(huán)境下分離提取小鼠腹股溝區(qū)脂肪組織，應(yīng)用眼科剪將其

2、剪碎至1mm3小組織塊，應(yīng)用 I型膠原酶及胰蛋白酶對(duì)其進(jìn)行消化，制成單細(xì)胞懸液，按照一定細(xì)胞濃度分裝于若干培養(yǎng)瓶中，加入適量含有10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，定期換液，觀察原代細(xì)胞形態(tài)并拍照。
　　2.待原代細(xì)胞爬滿培養(yǎng)瓶底80%以上時(shí)，對(duì)其進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行凍存及復(fù)蘇，探究其生物活性。
　　3.驗(yàn)證成功培養(yǎng)的第3代細(xì)胞的生物學(xué)特性，包括應(yīng)用MTT法繪制其生長曲線、通過加入

3、含有地塞米松0.1umol/L，維生素 C50umol/L，β-甘油磷酸鈉10mmol/L，胎牛血清10%的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，加入含有地塞米松10umol/L，胰島素10umol/L，吲哚美辛200umol/L，IBMX500umol/L，胎牛血清10%的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)其向脂肪細(xì)胞分化，探究其多分化潛能，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)方法驗(yàn)證其表面CD29、CD34、CD44、CD45的表達(dá)情況。
　　4.應(yīng)用差速貼壁法

4、對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行提純，應(yīng)用FCM方法檢測(cè)差速貼壁法培養(yǎng)組及普通培養(yǎng)法培養(yǎng)組細(xì)胞表面CD44表達(dá)率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　5.取balb/c小鼠27只，隨機(jī)分為3組，分別命名為A空白對(duì)照組、B模型對(duì)照組及C模型實(shí)驗(yàn)組，于d-1天，分別給予B、C組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，環(huán)磷酰胺濃度為10mg/ml，每只小鼠環(huán)磷酰胺用量為200mg/Kg，即每只小鼠需要注入10mg/ml環(huán)磷酰胺量為V=20m，于d0天給予B組小鼠尾靜脈注射生理鹽水0

5、.2ml，C組小鼠尾靜脈注射ADSCs0.2ml，細(xì)胞數(shù)量約為1×106，分別于d1、d3、d7應(yīng)用眼眶取血法取小鼠靜脈血，檢測(cè)血清中肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）及中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL，又名載脂蛋白-2）水平，并留取腎臟組織，做腎臟病理及HE染色，根據(jù)國際通用急性腎小管壞死程度的評(píng)分方法，對(duì)環(huán)磷酰胺引起的急性腎損傷進(jìn)行評(píng)分，對(duì)以上數(shù)

6、據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.成功從小鼠腹股溝區(qū)脂肪細(xì)胞培養(yǎng)出脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞呈梭形，聚集、漩渦狀生長，在第2、3代具有較強(qiáng)生長能力，適于進(jìn)行科學(xué)研究，4代以后細(xì)胞仍可傳代，但是細(xì)胞形態(tài)較前有差異，細(xì)胞呈網(wǎng)狀或鋪路石樣，在本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件下，最多培養(yǎng)10代后，細(xì)胞增殖活性明顯降低；
　　2.成功誘導(dǎo)ADSCs分化為成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞，經(jīng)茜素紅染色、油紅O染色證實(shí)，細(xì)胞成功分化為成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞，所培養(yǎng)A

7、DSCs具有多分化潛能；
　　3.小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞陽性表達(dá) CD29、CD44，不表達(dá) CD34、CD45；
　　4.應(yīng)用差速貼壁法所提純細(xì)胞CD44表達(dá)率為72%，普通培養(yǎng)組CD44表達(dá)率為55%，兩種培養(yǎng)方法具有顯著差別（P＜0.05），應(yīng)用差速貼壁法可培養(yǎng)出較高純度的ADSCs；
　　5.治療第1天及第3天可見模型對(duì)照組、模型實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組相比，病理形態(tài)未見明顯差別，鏡下均可見較清晰腎小球結(jié)構(gòu)，腎小管排列

8、規(guī)則，細(xì)胞排列較致密，而第7天所見模型對(duì)照組腎小球結(jié)構(gòu)稍有破壞，腎小球中細(xì)胞排列紊亂，腎小管變形，細(xì)胞核排列疏松，模型實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于模型對(duì)照組來說，結(jié)構(gòu)稍有好轉(zhuǎn)，對(duì)其腎臟病理評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，二組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，只提示稍有差別，但所取3個(gè)時(shí)間段模型實(shí)驗(yàn)組NGAL水平均較模型對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），第3天及第7天BUN及Scr水平較模型對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.成功分離、培養(yǎng)出了小鼠ADSCs