小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及純化及其對環(huán)磷酰胺引起的急性腎損傷的修復作用.pdf

1、目的：
　　1.分離并大量培養(yǎng)能夠穩(wěn)定傳代的小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs)，對其生物學特點進行描述及鑒定；
　　2.應用差速貼壁法對所培養(yǎng)的小鼠ADSCs進行純化，獲得高純度的ADSCs；
　　3.探究ADSCs對環(huán)磷酰胺引起的急性腎損傷的修復作用。
　　方法：
　　1.在無菌環(huán)境下分離提取小鼠腹股溝區(qū)脂肪組織，應用眼科剪將其

2、剪碎至1mm3小組織塊，應用 I型膠原酶及胰蛋白酶對其進行消化，制成單細胞懸液，按照一定細胞濃度分裝于若干培養(yǎng)瓶中，加入適量含有10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基于標準環(huán)境下進行培養(yǎng)，定期換液，觀察原代細胞形態(tài)并拍照。
　　2.待原代細胞爬滿培養(yǎng)瓶底80%以上時，對其進行傳代培養(yǎng)，取第3代對數(shù)生長期細胞進行凍存及復蘇，探究其生物活性。
　　3.驗證成功培養(yǎng)的第3代細胞的生物學特性，包括應用MTT法繪制其生長曲線、通過加入

3、含有地塞米松0.1umol/L，維生素 C50umol/L，β-甘油磷酸鈉10mmol/L，胎牛血清10%的成骨誘導培養(yǎng)基，誘導其向成骨細胞分化，加入含有地塞米松10umol/L，胰島素10umol/L，吲哚美辛200umol/L，IBMX500umol/L，胎牛血清10%的成脂誘導培養(yǎng)基，誘導其向脂肪細胞分化，探究其多分化潛能，應用流式細胞術(shù)方法驗證其表面CD29、CD34、CD44、CD45的表達情況。
　　4.應用差速貼壁法

4、對所培養(yǎng)細胞進行提純，應用FCM方法檢測差速貼壁法培養(yǎng)組及普通培養(yǎng)法培養(yǎng)組細胞表面CD44表達率，并進行統(tǒng)計學分析。
　　5.取balb/c小鼠27只，隨機分為3組，分別命名為A空白對照組、B模型對照組及C模型實驗組，于d-1天，分別給予B、C組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，環(huán)磷酰胺濃度為10mg/ml，每只小鼠環(huán)磷酰胺用量為200mg/Kg，即每只小鼠需要注入10mg/ml環(huán)磷酰胺量為V=20m，于d0天給予B組小鼠尾靜脈注射生理鹽水0

5、.2ml，C組小鼠尾靜脈注射ADSCs0.2ml，細胞數(shù)量約為1×106，分別于d1、d3、d7應用眼眶取血法取小鼠靜脈血，檢測血清中肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）及中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL，又名載脂蛋白-2）水平，并留取腎臟組織，做腎臟病理及HE染色，根據(jù)國際通用急性腎小管壞死程度的評分方法，對環(huán)磷酰胺引起的急性腎損傷進行評分，對以上數(shù)

6、據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果：
　　1.成功從小鼠腹股溝區(qū)脂肪細胞培養(yǎng)出脂肪間充質(zhì)干細胞，細胞呈梭形，聚集、漩渦狀生長，在第2、3代具有較強生長能力，適于進行科學研究，4代以后細胞仍可傳代，但是細胞形態(tài)較前有差異，細胞呈網(wǎng)狀或鋪路石樣，在本實驗培養(yǎng)條件下，最多培養(yǎng)10代后，細胞增殖活性明顯降低；
　　2.成功誘導ADSCs分化為成骨細胞及脂肪細胞，經(jīng)茜素紅染色、油紅O染色證實，細胞成功分化為成骨細胞及脂肪細胞，所培養(yǎng)A

7、DSCs具有多分化潛能；
　　3.小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞陽性表達 CD29、CD44，不表達 CD34、CD45；
　　4.應用差速貼壁法所提純細胞CD44表達率為72%，普通培養(yǎng)組CD44表達率為55%，兩種培養(yǎng)方法具有顯著差別（P＜0.05），應用差速貼壁法可培養(yǎng)出較高純度的ADSCs；
　　5.治療第1天及第3天可見模型對照組、模型實驗組及空白對照組相比，病理形態(tài)未見明顯差別，鏡下均可見較清晰腎小球結(jié)構(gòu)，腎小管排列

8、規(guī)則，細胞排列較致密，而第7天所見模型對照組腎小球結(jié)構(gòu)稍有破壞，腎小球中細胞排列紊亂，腎小管變形，細胞核排列疏松，模型實驗組相對于模型對照組來說，結(jié)構(gòu)稍有好轉(zhuǎn)，對其腎臟病理評分進行統(tǒng)計學分析，二組無統(tǒng)計學意義，只提示稍有差別，但所取3個時間段模型實驗組NGAL水平均較模型對照組顯著降低（P＜0.05），第3天及第7天BUN及Scr水平較模型對照組顯著降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.成功分離、培養(yǎng)出了小鼠ADSCs