PNRC在核仁的定位、功能及其剪接變異體的分析.pdf

1、核受體(nuclear receptor，NR)是一類轉錄因子，在調節(jié)機體的生殖、發(fā)育和體內穩(wěn)態(tài)等過程中發(fā)揮極其重要的作用。核受體調節(jié)基因的轉錄通常需要募集輔調節(jié)子(coregulator)。在配體的作用下，核受體的構象發(fā)生變化，變募集輔抑制子(corepressor)為募集輔活化子(coactivator)，靶基因轉錄從抑制轉變?yōu)榧せ睢?富含脯氨酸核受體輔調節(jié)蛋白(proline-rich nuclear receptor c

2、oregulator protein，PNRC)是以類固醇衍生因子l(steroidogenic factor1，SF1)為誘餌，利用酵母雙雜交技術從人乳腺cDNA表達文庫篩選并鑒定的一核受體輔活化子(coactivator)，除與SF1和孤兒受體ERRa及ERR7相互作用外，PNRC還與ERα、ERβ、PR、GR、TR、RAR和RXR等核受體相互作用，增強其介導轉錄激活。此外，PNRC還能與Grb2相互作用，下調Ras和MAP激酶的激

3、活。最近又發(fā)現(xiàn)PNRC通過與RNA多聚酶III(RNApolIII)亞基RPC39結合刺激RNA pol III介導的轉錄。 PNRC主要在細胞核內發(fā)揮功能，先前的研究也表明PNRC分子主要定位在細胞核內，但PNRC只有327氨基酸，分子量35.2 kD，理論上能自由進出細胞核，因此我們推測PNRC分子上存在一定的核定位信號序列(nuclear localization signal，NLS)使其定位在細胞核內而不擴散到胞漿中

4、。本研究在鑒定PNRC NLS的過程中，發(fā)現(xiàn)PNRC定位在核仁中并參與RNA多聚酶I(RNApol I)介導的核糖體RNA(rRNA)的合成。通過一系列的突變分析，我們鑒定位于94-101的氨基酸序列(94PKKRRKKK101)為PNRC的核仁定位序列(nucleolar targeting sequence，NTS)以及NLS。將此序列直接融合到綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)能將其帶到細

5、胞核和核仁中。對PNRC NTS上的氨基酸殘基進行逐點替代突變分析，發(fā)現(xiàn)位于氨基酸序列第100位的賴氨酸(lysine-100)是其NTS的關鍵殘基，但不是NLS的關鍵殘基，因為突變此氨基酸能顯著減少PNRC在核仁的定位，但不改變PNRC在細胞核中的定位。另外，我們證明像KKRRKK、KKKKKK和RRRRRR等連續(xù)的6個堿性氨基酸殘基就足于將GFP帶到核仁，因此它們可以做為潛在的NTS。通過免疫共沉淀實驗我們發(fā)現(xiàn)PNRC與核仁的主要蛋

6、白-核磷蛋白(B23/nucleophosmin)相互作用，且PNRC作用位點為其NTS。我們還發(fā)現(xiàn)：當用低劑量放線菌素D(actinomycin D)抑制核糖體DNA(rDNA)的轉錄時，PNRC從核仁轉位到核漿中，而用蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞則可增加PNRC在核仁的積累。此外，在乳腺癌細胞系MCF-7細胞中，用小干擾RNA(siRNA)敲低PNRC的表達能顯著減少核糖體RNA(rRNA)的合成以及特異性地降低參與rRNA合成

7、的核仁素(C23/nucleolin)的蛋白水平，而過表達PNRC則能升高核仁素的蛋白水平。總之，我們的結果表明PNRC是一核仁蛋白，位于94-101的氨基酸序列(94PKKRRKKK101)是其NTS，也是其NLS。PNRC可能通過這一序列與B23相互作用而定位到核仁中，并通過調節(jié)核仁素蛋白的水平參與rRNA的合成。 由于mRNA水平的選擇性剪接是調節(jié)蛋白功能的一個重要手段，本課題在生物信息學分析的基礎上，通過克隆測序的策略鑒

8、定了三個PNRC剪接變異體，分別命名為PNRClc。PNRCld和PNRC1fPNRClc和PNRClf是在PNRC基因外顯子1中選擇性剪切掉部分序列的產(chǎn)物，而PNRCld則為PNRC基因選擇性使用另外一個啟動子的產(chǎn)物。PNRCl c在選擇性剪接位點后面的序列未發(fā)生翻譯的讀碼移框，而只是框內刪除79個氨基酸，而PNRClf則在選擇性剪接位點其后的序列發(fā)生讀碼移框，并提前出現(xiàn)終止密碼子，PNRCld編碼出的蛋白則為組成性剪接PNRC分子C