大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合兩種不同nHA-PCL電紡支架的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立一種對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定的方法體系，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行觀察；BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化，鑒定其成骨能力；成骨誘導(dǎo)細(xì)胞與兩種不同溫度下制備而成的nHA/PCL電紡薄膜復(fù)合形成復(fù)合物，并評(píng)價(jià)細(xì)胞－材料的生物相容性，為臨床上應(yīng)用組織工程骨修復(fù)骨缺損提供理論依據(jù)。
　　方法：1.在無菌條件下，取大鼠骨髓細(xì)胞，結(jié)合密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法，分離大鼠BMSCs，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生

2、物學(xué)形態(tài)，流式細(xì)胞儀鑒定其表面抗原CD29、CD90及CD34，CCk－8法繪制第1代和第3代的生長曲線。2.取生長良好的第3代細(xì)胞，在地塞米松、β－磷酸甘油鈉、L－抗壞血酸的誘導(dǎo)培養(yǎng)下，使之向成骨細(xì)胞分化，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)改變。第7、10、14d，對(duì)成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶檢測；在第14d，對(duì)成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞行von kossa礦化結(jié)節(jié)染色。3.取第3代的大鼠BMSCs，以2×105/cm2的密度接種于材料中，靜置2h后再加2

3、ml低糖DMEM/F12培養(yǎng)基(10％胎牛血清+0.1％青鏈霉素+10-7 mol/L地塞米松+10-2 mol/Lβ-磷酸甘油鈉+50mg/L的L-抗壞血酸)，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第6d、9d、14d，倒置顯微鏡大體觀察細(xì)胞-材料的復(fù)合情況。第7d，掃描電鏡觀察細(xì)胞-材料復(fù)合物的生物相容性。
　　結(jié)果：1.經(jīng)密度梯度離心和全骨髓貼壁法聯(lián)合培養(yǎng)，結(jié)合傳代所得到的細(xì)胞形態(tài)均一，呈長梭形。所分離的細(xì)胞CD2

4、9的表達(dá)率為94.97％，CD90的表達(dá)率為88.50％，CD34的表達(dá)率為2.23％。生長曲線顯示第3代細(xì)胞均有較強(qiáng)的增殖能力。但是，細(xì)胞傳至第8代時(shí)，其形態(tài)寬大畸形，呈樹枝狀。2.BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察，其形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞體積變大，由梭形逐漸變成立方形，之后細(xì)胞體積又逐漸變小，收縮、聚集形成鈣結(jié)節(jié)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，堿性磷酸酶活性明顯增高，von kossa礦化結(jié)節(jié)染色呈陽性反應(yīng)。3.BMSCs與支架復(fù)

5、合培養(yǎng)7 d，掃描電鏡觀察可見，大量BMSCs位于1號(hào)支架孔隙內(nèi)生長，增殖良好，細(xì)胞大多呈梭形，雙極突起，形態(tài)較佳，伸展良好，呈立體狀生長，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，且有纖維連接蛋白生成及鈣鹽沉積。2號(hào)材料，其表面覆蓋大量細(xì)胞，材料空隙內(nèi)細(xì)胞數(shù)目較少，細(xì)胞形態(tài)大多呈圓形，伸展不完全，伸出大量偽足黏附于材料表面。
　　結(jié)論：1.采用全骨髓培養(yǎng)法和密度離心法獲取的BMSCs，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs表面抗原，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，證明從骨髓