華蟾素注射液聯(lián)合PDTC對炎性刺激下A549細(xì)胞增殖的抑制效果及其相關(guān)作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)旨在研究華蟾素注射液（cinobufacini injection,CI）聯(lián)合吡咯烷二硫基甲酸鹽（pyrrolidine dithiocarbama,PDTC）對炎性刺激下A549細(xì)胞的增殖及LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子的抑制效果，并探討其與NF-κB信號通路的相關(guān)作用機(jī)制。為華蟾素注射液聯(lián)合P DTC防治炎癥促進(jìn)肺癌的惡化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.華蟾素注射液聯(lián)合PDTC對 A549細(xì)胞增

2、殖的抑制效果：接種A549細(xì)胞孵育貼壁，設(shè)對照組，PDTC組，華蟾素注射液組，聯(lián)合組，加藥作用24h、48h后，用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。
　　2.華蟾素注射液聯(lián)合PDTC對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞存活率的影響：接種RAW264.7細(xì)胞孵育貼壁，設(shè)對照組，LPS刺激組，LPS刺激PDTC組，LPS刺激華蟾素注射液組，LPS刺激聯(lián)合組，各處理組用脂多糖刺激2h，加藥作用24h后，用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。
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3、.華蟾素注射液聯(lián)合PDTC對炎癥因子的抑制效果：將RAW264.7細(xì)胞接種于12孔板，分組加LPS誘導(dǎo)2h，藥物孵育24h后，取上清液，用一氧化氮試劑盒檢測NO的含量，ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。
　　4.華蟾素注射液聯(lián)合P DTC對炎性刺激下A549細(xì)胞增殖的抑制效果：接種A549細(xì)胞孵育貼壁，設(shè)對照組，炎性刺激組，炎性刺激PDTC組，炎性刺激華蟾素注射液組，炎性刺激聯(lián)合組，并設(shè)立非炎性刺激組做對

4、比，炎性刺激組加入LPS刺激RAW264.7細(xì)胞上清培養(yǎng)基，藥物組分別加入上清培養(yǎng)基或正常培養(yǎng)基配制的藥物，孵育48h后，用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。
　　5.NF-κB p65與細(xì)胞核共定位：將RAW264.7細(xì)胞接種于cofocal小皿，分組加藥處理24h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察NF-κB p65與細(xì)胞核定位情況。
　　6.華蟾素注射液聯(lián)合PDTC抑制IκB-α的降解：將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板，分組加藥孵

5、育24h后，收集細(xì)胞，提取蛋白，用Western Blot檢測IκB-α蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：CCK-8結(jié)果顯示，華蟾素注射液及PDTC對A549細(xì)胞的增殖均有抑制效果，兩者聯(lián)合使用后，抑制作用更強(qiáng)（P＜0.05）。LPS、華蟾素注射液及PDTC對RAW264.7細(xì)胞存活率沒有影響（P＞0.05）。消炎效果顯示，RAW264.7細(xì)胞加LPS刺激后，各炎癥因子的含量明顯增加（P＜0.05），華蟾素注射與PDTC對NO、TNF-α、

6、IL-6、IL-1β均有不同程度的抑制效果，聯(lián)合使用后，抑制作用總體上高于單藥組。在炎性刺激下能促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖（P＜0.05），華蟾素注射液聯(lián)合PDTC對炎性刺激下A549細(xì)胞增殖的抑制效果仍高于單藥組（P＜0.05）。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，經(jīng)LPS刺激后，RAW264.7細(xì)胞中NF-κB p65的核位移明顯增多，華蟾素注射液與PDTC均能抑制NF-κB p65的核位移，聯(lián)合用藥后抑制效果更明顯。Wes tern Blo t

7、結(jié)果顯示， LPS能夠促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞中IκB-α的降解（P＜0.05），經(jīng)華蟾素注射液與PDTC處理后，IκB-α的降解減少，聯(lián)合作用后能夠提高對IκB-α降解的抑制效果（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.華蟾素注射液聯(lián)合PDTC能有效抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌，其對炎癥因子的抑制效果總體上高于單藥組。
　　2.炎性刺激下能促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖，華蟾