雙黃連注射液致敏反應特征及致敏標志物研究.pdf

1、中藥注射劑是我國傳統(tǒng)醫(yī)學和現代制藥技術相結合的產物，具有價格低廉、療效顯著等優(yōu)勢?，F今全國有400多家企業(yè)生產已有批準文號的109種中藥注射劑，年銷售額超過200億元，年使用量超過4億人次。
　　中藥注射劑由于其成分和制造工藝等方面的復雜性，近年來隨著臨床上的廣泛應用，出現了一系列以過敏反應為代表的不良反應。雙黃連注射液（Shuanghuanglian Injection）由金銀花、黃芩、連翹3味中藥的提取物配制而成，具有清熱解毒

2、的功效和抗菌抗病毒的藥理作用，臨床上用于治療上呼吸道感染等炎癥的療效較好，使用非常廣泛。不容忽視的是隨著使用量的增加，雙黃連注射液的不良反應也逐漸顯現出來。雙黃連注射液自2002年上市后，先后2次由于嚴重不良反應的發(fā)生在2001年11月第1期和2009年5月第22期由國家藥品不良反應監(jiān)測中心發(fā)布的《藥品不良反應信息通報》中被采取管制措施。雙黃連注射液為中藥注射劑大品種，在多篇研究報道中都可以看到其居于中藥注射劑不良反應首位，以雙黃連注射

3、液為例進行研究具有代表性及現實意義。本研究以雙黃連注射液為研究對象，對其體內、體外致敏特征和體內致敏標志物分別進行了系統(tǒng)性的研究:
　　本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 雙黃連注射液致敏特征體內研究
　　目的：明確雙黃連注射液過敏類型，研究其體內致敏特征。
　　方法：選用雌性，體質量18～20 g的Balb/c小鼠。依照如下研究方法進行給藥和觀察。
　?、裥瓦^敏反應，采用主動全身過敏試驗(ASA

4、)的方法，設定空白組、陽性藥卵清蛋白(OVA)組和雙黃連注射液臨床劑量組，研究藥物激發(fā)后小鼠全身過敏癥狀和全身皮膚血管通透性變化。
　　類過敏反應，根據雙黃連注射液的臨床給藥方式（一次性靜脈給藥），以臨床劑量為中心設置5個梯度給藥劑量（以雙黃連注射液生藥量1g·m1-1為換算基礎）即雙黃連注射液5，10，20，40，60g·kg-1（相當于臨床劑量0.5、1倍、2倍、4倍和6倍），觀察給藥60min內小鼠全身和局部的過敏癥狀、血清

5、IgE、組胺含量變化、腸壁及腸系膜、皮膚血管通透性的改變等指標。
　　結果：主動全身過敏試驗(ASA)的方法給藥后，雙黃連注射液組小鼠全身過敏癥狀評分結果為陰性，皮膚血管通透性未見明顯變化。雙黃連注射液一次性靜脈給藥后，高劑量（雙黃連注射液40，60g·kg-1）組在給藥短時間內小鼠即出現呼吸困難、眼眶水腫、眼角分泌物持續(xù)增多等嚴重過敏癥狀，與空白組比較腸壁及腸系膜、皮膚血管通透性均增加。各給藥組小鼠血清IgE含量未發(fā)生顯著性變化

6、，血清組胺含量顯著性升高。
　　結論：雙黃連注射液的臨床常見過敏類型為類過敏反應，這種過敏反應在首次給藥后短時間內即可發(fā)生。
　　第二部分 雙黃連注射液致敏標志物的研究
　　目的：對實驗動物體內響應雙黃連注射液促成過敏反應發(fā)生的可疑蛋白進行篩選。
　　方法：依照雙黃連注射液體內致敏特征研究中類過敏模型的制作方法準備待檢動物血清，將各給藥組和空白組小鼠血清中蛋白成分進行聚類分析，利用TMT化學標記方法，Q-Exat

7、ive液質聯用平臺對不同雙黃連注射液劑量組的小鼠血清中蛋白成分進行相對定量檢測。
　　結果：聚類分析結果顯示各給藥組與未給藥組小鼠血清中相似蛋白聚類清晰，易于區(qū)分。共發(fā)現98種蛋白含量相對變化值＞1.5或＜0.67，且P＜0.05的可疑蛋白，免疫系統(tǒng)和免疫疾病相關的蛋白數量最多，共有10個。
　　結論：實驗結果進一步驗證了雙黃連注射液類過敏反應發(fā)生與免疫系統(tǒng)具有緊密的關聯性，體內存在對雙黃連注射液進行響應并引起類過敏反應的蛋

8、白，為進一步確定目標蛋白提供了較為可靠的依據。
　　第三部分 雙黃連注射液致敏特征體外研究
　　目的：研究雙黃連注射液（雙黃連注射液）及其中間品（金銀花連翹提取物、黃芩提取物）的不同濃度對RBL-2H3細胞增殖和形態(tài)的影響，研究雙黃連注射液對RBL-2H3細胞凋亡和脫顆粒的影響。
　　方法：將雙黃連注射液以體積比1∶16為初始濃度，按2倍梯度稀釋至1∶4096作為受試樣品。其中間品金銀花、黃芩連翹提取物分別以體積比1∶

9、8為初始濃度，按2倍梯度稀釋至1∶2048作為受試樣品。以各受試樣品分別孵育RBL-2H3細胞，觀察細胞形態(tài)變化。應用MTT比色法測定各組RBL-2H3細胞增殖活力，并計算細胞增殖的半數抑制濃度(IC50)。根據IC50設置不同給藥濃度，觀察了雙黃連注射液對RBL-2H3細胞凋亡的影響，以Compound48/80為陽性藥檢測雙黃連注射液對RBL-2H3細胞β-氨基己糖苷酶釋放的影響情況。
　　結果：隨著給藥濃度的升高，雙黃連注射

10、液及其中間品對細胞增殖的抑制作用逐漸增強，細胞存活力明顯降低，細胞損傷逐漸加重，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。隨著雙黃連注射液給藥濃度的升高細胞凋亡情況逐漸加深，胞外β-氨基己糖苷酶含量降低，并經測算得到雙黃連注射液及中間品的IC50。
　　結論：高劑量雙黃連注射液對RBL-2H3細胞增殖存在一定影響，雙黃連注射液并不能直接促進RBL-2H3細胞脫顆粒。為雙黃連注射液類過敏細胞模型的建立、評價雙黃連注射液及中間品的安全性及藥物質量控制提供