胡椒堿對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系表達(dá)炎癥因子和抗菌肽的影響.pdf

1、目的：
　　胡椒堿(Piperine，Pip)是胡椒(Piper nigrum Linn)和蓽茇(Piper longum Linn)等胡椒屬植物果實(shí)中提取的一種植物堿，是胡椒中發(fā)揮藥理作用的主要成分。近年的研究表明胡椒堿具有明確的抗炎效應(yīng)并且對(duì)多種胃腸疾病具有療效，但關(guān)于胡椒堿在腸炎方面的研究很少，其抗腸炎作用的機(jī)制也還不夠清楚。本課題通過(guò)利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或滅活的金黃色葡萄球菌(Stap

2、hylococcus aureus cells，SAC)分別刺激人結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480、HT-29和Caco-2細(xì)胞)，體外模擬人腸道感染細(xì)菌發(fā)生炎癥，檢測(cè)Pip對(duì)LPS或SAC作用下這些細(xì)胞表達(dá)炎癥因子、抗菌肽防御素以及對(duì)NF-κB信號(hào)通路、MAPKs信號(hào)通路活化的影響，初步探討Pip發(fā)揮抗腸炎作用的機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用改進(jìn)的MTT法(WST-1)檢測(cè)Pip對(duì)SW480、HT-29、Caco-2細(xì)胞增殖的作

3、用；利用流式微球捕獲蛋白定量技術(shù)(Cytometric beads array，CBA)檢測(cè)Pip對(duì)LPS刺激SW480和HT-29細(xì)胞分泌炎癥因子IL-8和IL-10的蛋白表達(dá)水平的影響，并用RT-qPCR(Reverse Transcription-Quantitative PCR)檢測(cè)炎癥因子 mRNA表達(dá)水平的變化；免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè) Pip對(duì)LPS活化的SW480細(xì)胞 NF-κB信號(hào)通路、ERK

4、、p38 MAPK和JNK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用；利用 CBA和RT-qPCR分別在蛋白質(zhì)水平以及 mRNA水平上分析 p38 MAPK和JNK信號(hào)通路阻斷情況，即在SB203580(p38 MAPK信號(hào)通路抑制劑)和SP600125(JNK信號(hào)通路抑制劑)作用下，對(duì)LPS刺激SW480和HT-29細(xì)胞表達(dá)IL-8的影響。
　　2.利用RT-qPCR檢測(cè)Pip對(duì)LPS和SAC抑制HT-29、Caco-2細(xì)胞表達(dá)抗菌肽人α防御素HD5(

5、human alpha-defensin-5)和HD6(human alpha-defensin-6)，人β防御素 HBD-1(human beta-defensin-1)以及胰島再生源蛋白(regenerating islet-derived protein，Reg) RegⅢγmRNA的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：
　　1. Pip處理可劑量依賴(lài)性地抑制SW480、HT-29和Caco-2細(xì)胞的增殖，半數(shù)抑制濃度IC50分別為

6、147.6μM、328.5μM和155.1μM，表明Pip對(duì)這些細(xì)胞的毒性較小。CBA和RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示Pip能從蛋白質(zhì)水平及 mRNA水平上抑制由LPS誘導(dǎo)的SW480和HT-29細(xì)胞表達(dá)IL-8，且蛋白質(zhì)水平上的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系；而免疫印跡分析表明，Pip可抑制LPS誘導(dǎo)的p38 MAPK和JNK信號(hào)通路的活化；CBA和RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示使用 SB203580抑制p38 MAPK信號(hào)通路后，由 LPS誘導(dǎo)的

7、細(xì)胞表達(dá) IL-8無(wú)論在蛋白質(zhì)水平及mRNA水平上均有顯著下調(diào)。
　　2. RT-qPCR檢測(cè)顯示，HT-29和Caco-2細(xì)胞HD5、HD6的mRNA表達(dá)水平在LPS或SAC的刺激下均有顯著下降，而Pip對(duì)LPS或SAC下調(diào)HT-29和Caco-2細(xì)胞表達(dá)抗菌肽防御素具有顯著的拮抗作用。
　　結(jié)論：
　　1. Pip能抑制LPS刺激的SW480和HT-29細(xì)胞分泌炎癥因子IL-8從而發(fā)揮抗炎作用，其機(jī)制很可能與抑制p