喜樹堿對結(jié)腸癌細胞系誘導(dǎo)性一氧化氮合酶合成的影響.pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文喜樹堿對結(jié)腸癌細胞系誘導(dǎo)性一氧化氮合酶合成的影響姓名：沈香娣申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：陳增良20060501浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文將生長至對數(shù)生長期的Sw鋁O細胞經(jīng)胰蛋自酶消化后，以約20l釅個，孔接弛于96孔培養(yǎng)板中，放入37℃、5％c02的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時，細胞貼壁后小心棄去舊培養(yǎng)基，每孔加200此含10％新生小牛血清(BCs)、lO肛g，I，的脂多糖(LPs)、20ng，L的自介素

2、lp(IL—ip)的DMEM培養(yǎng)基，加入不同終濃度的喜樹堿溶液分別作用與上述細胞。②測定iNOsInI礬A和蛋白生成量的實驗細胞準(zhǔn)備將生長至對數(shù)生長期的sw480細胞消化后以2106，瓶的細胞數(shù)培養(yǎng)，放入37℃、5％C02的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12，J、時，纓胞貼壁后小心棄去f匿培養(yǎng)基，每瓶加lOmL含10％BCS、10州L的LPS、20119／L的ILlp的DMEM培養(yǎng)基，將終濃度為O125p咖nL、O25“咖L的喜樹堿加入上述準(zhǔn)備的細胞作

3、用24小時。2喜樹堿對SW480細脆N0生成量的影響(1)取50、100、150、200#moUL的N烈02各100虬，加GrieSS試劑，青4得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算標(biāo)準(zhǔn)方程。(2)按前述準(zhǔn)備的細胞分剮培養(yǎng)18小時、24小時，用Griess法測NO的生成量，同時用Mrr法測細胞的存活率。3喜樹堿對S、張80細胞iNOsmRNA表達的影響按1Hzlo試劑盒說明一步法提取Sw480細胞的總RNA，用紫外線分光光度計測定RNA的純度并定量。取總RN

4、A進行逆轉(zhuǎn)錄，然盾再進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在15％瓊脂糖凝膠上電泳，應(yīng)用凝膠掃攢儀對電泳帶進行吸光度掃描，并以GAPDH校正做相對量分析，數(shù)值以兩者積分吸光度的比值表示。4喜樹堿對Sw480細脆iNOS蛋白質(zhì)表達的影晌將實驗sw480細胞消化離心后加蛋白裂解液提取總蛋白，測定蛋白濃度，上樣，電泳，然后轉(zhuǎn)移樣品至硝酸纖維素膜上。封閉，加一抗、二抗雜交，用HRP—ECL發(fā)光法檢測，見淡綠色熒光條帶，將膜固定予膠片盒中，曝光后顯影，定影。應(yīng)