金黃色葡萄球菌廣譜噬菌體的分離及其體外裂菌活性研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）是一種常見的病原菌，可引起多種嚴(yán)重的感染性疾病。由于抗生素過度使用等原因，導(dǎo)致嚴(yán)重耐藥和多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，對其感染的治療也變得越來越困難。因此，尋找有效控制耐藥性金黃色葡萄球菌感染的新方法十分迫切。噬菌體（Bacteriophage）是一種細(xì)菌病毒，可高效、專一侵染細(xì)菌，并通過大量復(fù)制最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。噬菌體不會破壞人或動物機(jī)體內(nèi)正常的微生物菌群平衡，以

2、其特有的自然殺菌特征呈現(xiàn)獨(dú)特的抗菌應(yīng)用潛力。因此，本文基于耐藥性金黃色葡萄球菌的分離、鑒定，獲得了具有廣譜裂菌特性的噬菌體，完成了噬菌體的病毒學(xué)特性和裂菌活性研究。
　　為了分離、鑒定金黃色葡萄球菌，基于葡萄球菌屬特異性基因—16S rRNA、金黃色葡萄球菌屬特異性基因—耐熱核酸酶基因（nuc）以及金黃色葡萄球菌的甲氧西林抗性基因(mecA)，設(shè)計(jì)了3對引物，通過PCR方法，成功鑒定54株金黃色葡萄球菌和29株葡萄球菌，其中18株

3、為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。
　　為了獲得金黃色葡萄球菌噬菌體，采取了從溶源菌中誘導(dǎo)和從環(huán)境中分離兩種策略?；诮z裂霉素C誘導(dǎo)法和雙層瓊脂平板分離法，分別從金黃色葡萄球菌 ATCC29213菌株和環(huán)境中獲得兩株金黃色葡萄球菌噬菌體，并分別命名為 SLPN和SLPW；二者均能與指示菌形成圓形、透明、邊緣光滑的噬菌斑，直徑約為1 mm~3 mm；基于雙層瓊脂平板法進(jìn)行的效價測定，發(fā)現(xiàn)二者效價分別為5.7×1010 PFU/mL和8.7

4、×109 PFU/mL；經(jīng)透射電鏡觀察，噬菌體SLPN和SLPW的形態(tài)非常相似，頭部均呈現(xiàn)二十面體立體對稱，直徑約48 nm~51 nm，均含非收縮性的尾部，長約18 nm~21 nm，屬于短尾噬菌體科；分別用DNaseⅠ、RNaseA和Mung Bean Nuclease消化兩株噬菌體的基因組，結(jié)果顯示二者均為雙鏈DNA病毒；基于鳥槍法，對噬菌體SLPW基因組進(jìn)行測序，結(jié)果顯示，基因組全長為17,861 bp，由20個開放閱讀框（OR

5、Fs）組成。
　　為了揭示噬菌體的生物學(xué)特征，基于雙層瓊脂平板法，研究了兩株噬菌體 SLPN和SLPW的裂菌譜和理化特性。結(jié)果表明，噬菌體SLPN和SLPW均有較寬的裂菌譜，二者對16株MRSA菌株均表現(xiàn)出極強(qiáng)的裂菌活性，而且從環(huán)境中分離到的噬菌體SLPW對2株食源性及13株臨床分離的金黃色葡萄球菌也有很好的裂解作用，但是通過誘導(dǎo)獲得的噬菌體SLPN則只對1株食源性及5株臨床分離的金黃色葡萄球菌具有裂解作用。同時，噬菌體SLPN和

6、SLPW均表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性和較寬的pH耐受范圍。在60℃以下，作用1 h都能保持良好的活性；在pH4~pH11范圍內(nèi)，仍保持良好的侵染能力。此外，噬菌體SLPN和SLPW都對紫外線和氯仿不敏感，經(jīng)紫外線照射1 h后，二者的效價均未發(fā)生明顯變化；經(jīng)75％氯仿處理24 h后，二者仍保持較高的感染能力，效價均在107 PFU/mL以上，表明兩株噬菌體均無囊膜。經(jīng)測定，噬菌體SLPN和SLPW的最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）分別為10和0.1。一步

7、生長曲線表明，噬菌體SLPN和SLPW的潛伏期分別為20 min和10 min，裂解期分別為80 min和110 min，裂解量分別為80.4和95.3。噬菌體 SLPN和SLPW對 Mg2+均不敏感，而10 mmol/L和15 mmol/L的Ca2+對二者的裂菌能力均有增強(qiáng)作用。對于噬菌體的最佳保存方法，初步研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體SLPN和SLPW在4℃條件下，存放3個月后，效價均下降5~6個數(shù)量級；在-20℃或-80℃的低溫條件下加20%

8、甘油保存3個月后，仍能保持初始效價，提示本文分離的兩株噬菌體均適合在添加20%甘油的低溫條件下保存。
　　為了闡明噬菌體的抗菌應(yīng)用潛力，開展了體外殺菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在液體培養(yǎng)基中，噬菌體SLPN和SLPW對不同的MRSA菌株都具有很強(qiáng)的裂菌作用，幾乎都能在1h~2h內(nèi)徹底裂解指示菌，且無耐噬菌體的細(xì)菌突變株產(chǎn)生。在平板抑菌、殺菌實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)噬菌體噴霧處理過的平板上，菌落較少甚至無菌落形成。以上結(jié)果表明，噬菌體SLPN和SLPW不僅