聯(lián)合嗅鞘細(xì)胞及GDNF的生物可降解膜系統(tǒng)的性質(zhì)研究.pdf

1、神經(jīng)修復(fù)在臨床上一直是一個(gè)困擾著臨床醫(yī)生的難題，近年來(lái)隨著科學(xué)的進(jìn)步，在損傷神經(jīng)修復(fù)方面獲得了可喜的進(jìn)步。而目前前列腺癌的發(fā)病率逐年上升，其治療的金標(biāo)準(zhǔn)是采用根治手術(shù)切除前列腺，而手術(shù)過(guò)程中會(huì)因?yàn)殂Q夾、燒灼、牽拉等原因不可避免的造成海綿體神經(jīng)的損傷。更為特殊的是，海綿體神經(jīng)擁有著獨(dú)特的網(wǎng)狀神經(jīng)結(jié)構(gòu)，目前仍沒(méi)有理想的方式來(lái)進(jìn)行受損海綿體神經(jīng)的修復(fù)。針對(duì)海綿體神經(jīng)的特殊解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，我們擬采用膜狀結(jié)構(gòu)全面覆蓋在受損的海綿體神經(jīng)段上，以起到支撐

2、、保護(hù)和引導(dǎo)海綿體神經(jīng)再生的作用。
　　靜電紡絲技術(shù)是目前支架結(jié)構(gòu)的新興技術(shù)，應(yīng)用該技術(shù)制造的納米纖維支架具有較大的比表面積和較高的孔隙率，不但有利于生長(zhǎng)因子、酶等生物大分子的吸附，還有利于細(xì)胞的附著和鋪展，同時(shí)有利于細(xì)胞和微環(huán)境之間進(jìn)行物質(zhì)交換。聚乳酸—乙醇酸聚合物[Poly(DL-lactic-co-glycolicacid)， PLGA]具有良好的生物相容性和可降解性，運(yùn)用靜電紡絲技術(shù)和PLGA材料可以制作出理想的細(xì)胞支架。

3、
　　嗅鞘細(xì)胞（Olfactory Ensheathing cells，OECs）是來(lái)源于嗅上皮基底膜的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其分布區(qū)域位于嗅神經(jīng)和嗅球，可分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)細(xì)胞粘附因子，起到幫助損傷神經(jīng)元存活、促進(jìn)軸突再生和髓鞘化的作用，在神經(jīng)再生中扮演著重要的角色。
　　GDNF(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)是最有效的體外支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，具有保

4、護(hù)損傷神經(jīng)、減少神經(jīng)元死亡、促進(jìn)神經(jīng)纖維再生和幫助運(yùn)動(dòng)功能重建的功效。
　　在第一部分，我們采用了改良的Nash法培養(yǎng)了高純度的OECs，免疫熒光鑒定了其純度。在第二部分，我們采用慢病毒轉(zhuǎn)染嗅鞘細(xì)胞獲得了高表達(dá)GDNF的嗅鞘細(xì)胞，并用GFP熒光表達(dá)、蛋白印跡和PCR法加以證實(shí)。第三部分，我們將高表達(dá)GDNF的OECs種于電紡PLGA膜上，從體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)共同驗(yàn)證了其生物相容性。最終我們得到了聯(lián)合嗅鞘細(xì)胞及GDNF的電紡PLGA可降

5、解膜系統(tǒng)，這是一個(gè)理想的生物工程學(xué)神經(jīng)移植物。
　　第一部分 嗅球源OECs分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的:從大鼠嗅球取材原代嗅鞘細(xì)胞，光鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)和增殖情況，運(yùn)用免疫熒光技術(shù)鑒定嗅鞘細(xì)胞純度。
　　方法:采用改良的Nash法從120g大鼠嗅球中取材嗅鞘細(xì)胞，運(yùn)用包含bFGF、Forskolin和20％FBS的DEME/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞，在光鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)和增殖情況，使用p75NGFR免疫熒光染色鑒定嗅

6、鞘細(xì)胞純度。
　　結(jié)果:采用改良的nash法，我們成功的獲得了活性高、狀態(tài)好、增殖能力強(qiáng)的嗅鞘細(xì)胞，體外最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)30天，但是細(xì)胞活性狀態(tài)較好的天數(shù)為14天內(nèi)。p75NGFR免疫熒光顯示嗅鞘細(xì)胞純度在95％以上。
　　結(jié)論:采用改良的nash法可以獲得高純度的原代嗅鞘細(xì)胞，但是嗅鞘細(xì)胞是成熟的體細(xì)胞，不具有無(wú)限增殖的特性，在體外雖然可以大量增殖，但是存活時(shí)間有限，需要在30天內(nèi)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，超過(guò)30天后細(xì)胞活性差且細(xì)

7、胞大量死亡，最佳天數(shù)是在14天以?xún)?nèi)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
　　第二部分 慢病毒轉(zhuǎn)染獲得高表達(dá)GDNF的嗅鞘細(xì)胞及鑒定
　　目的:獲得高表達(dá)GDNF的嗅鞘細(xì)胞，并鑒定其能否高表達(dá)GDNF。以聯(lián)合GDNF和嗅鞘細(xì)胞共同用于神經(jīng)修復(fù)。
　　方法:運(yùn)用含有GDNF基因的慢病毒轉(zhuǎn)染嗅鞘細(xì)胞，在熒光下觀察細(xì)胞GFP熒光表達(dá)情況確定病毒轉(zhuǎn)染率，應(yīng)用PCR驗(yàn)證GDNF基因過(guò)表達(dá)情況，應(yīng)用蛋白印跡驗(yàn)證GDNF蛋白生成情況。
　　結(jié)果:熒光

8、下觀察到細(xì)胞GFP表達(dá)在MOL為50∶1的情況下為50％，表明病毒轉(zhuǎn)染率為50％。同時(shí)PCR驗(yàn)證GDNF基因過(guò)表達(dá)情況為對(duì)照組正常細(xì)胞的130倍。蛋白印跡分析顯示高表達(dá)GDNF的嗅鞘細(xì)胞能產(chǎn)生GDNF蛋白，而正常的嗅鞘細(xì)胞蛋白印跡結(jié)果為陰性。
　　結(jié)論:通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染嗅鞘細(xì)胞可以獲得高表達(dá)GDNF的嗅鞘細(xì)胞，其細(xì)胞狀態(tài)好，增殖活性強(qiáng)，能夠用于細(xì)胞移植來(lái)修復(fù)神經(jīng)。
　　第三部分 電紡PLGA膜與嗅鞘細(xì)胞生物相容性研究
　

9、　目的:探索大鼠嗅鞘細(xì)胞和靜電紡絲制作的PLGA膜的生物相容性。
　　方法:體外培養(yǎng)純化成年大鼠嗅鞘細(xì)胞，接種于靜電紡絲PLGA膜上，使用相差顯微鏡觀察和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)評(píng)估細(xì)胞在PLGA膜上的粘附和生長(zhǎng)情況;將靜電紡絲PLGA膜植入大鼠體內(nèi)觀察其在體內(nèi)的組織相容性。
　　結(jié)果:相差顯微鏡顯示嗅鞘細(xì)胞能在靜電紡絲PLGA膜上粘附和存活;細(xì)胞計(jì)數(shù)分析表明細(xì)胞增殖正常;電鏡下嗅鞘細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好;體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)靜電紡絲PLGA膜