利用通用型聚二甲基硅氧烷微孔陣列微反應(yīng)器研究空間堆疊因素對人脂肪干細(xì)胞增殖、凋亡、分化的影響.pdf

1、將種子細(xì)胞與多孔支架（人工合成或天然）混合后培養(yǎng)是組織工程體外實(shí)驗(yàn)的主要模式，再配合特定培養(yǎng)條件使種子細(xì)胞向特定方向分化、增殖，可以滿足定向組織構(gòu)建的需求。脂肪干細(xì)胞具有取材難度低、增殖活性高、分化方向多、表型表達(dá)穩(wěn)定等特性，是目前組織工程研究比較理想的種子細(xì)胞。
　　現(xiàn)階段，越來越多的學(xué)者認(rèn)識到支架內(nèi)部空間立體因素對種子細(xì)胞增殖、分化存在影響。但由于常用的支架材料大多不透明，如要觀察所種植細(xì)胞的行為大多需要通過破壞細(xì)胞所處微環(huán)境

2、方能實(shí)現(xiàn)。如果能夠在保持細(xì)胞及周圍微環(huán)境相對穩(wěn)定的情況下進(jìn)行無干擾的觀察、檢測，將對解釋空間立體因素作用于細(xì)胞的機(jī)制提供巨大的幫助。
　　隨著微尺度技術(shù)(Micro-scale technologies)的發(fā)展，研究者可以設(shè)計(jì)、制作微米級甚至納米級細(xì)胞培養(yǎng)平臺。其中，微孔陣列(Microwells)實(shí)驗(yàn)平臺因其具有加工難度低、生物親和度高、通用性強(qiáng)、設(shè)備需求度低等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程領(lǐng)域已獲得越來越多的關(guān)注。利用這一平臺可以實(shí)現(xiàn)對所種

3、植細(xì)胞幾乎無干擾的觀察，為高效率研究物理、空間因素對細(xì)胞增殖、分化的影響提供了契機(jī)。
　　目的：利用高精度微尺度技術(shù)制作出不同孔徑的微米級聚二甲基硅氧烷(PDMS)微孔陣列，再將人脂肪干細(xì)胞以一定濃度接種于其中，使細(xì)胞在不同直徑微孔內(nèi)呈現(xiàn)多種層疊狀態(tài)（單層、多層）。通過對不同層疊狀態(tài)下細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等行為進(jìn)行檢測，一方面驗(yàn)證此實(shí)驗(yàn)平臺的安全性，另一方面在保持細(xì)胞外微環(huán)境不被破壞的前提下對細(xì)胞的生物學(xué)行為進(jìn)行觀察、分析，著重

4、探討空間立體因素對人脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng)中增殖及分化行為的影響。
　　方法：(1)通用型PDMS微孔陣列微反應(yīng)器的構(gòu)建:借助高精度微尺度技術(shù)在硅晶元表面制作高度為50μm及直徑分別為60μm、80μm、100μm和150μm的微柱狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)聚二甲基硅氧烷(PDMS)倒模生成同規(guī)格孔徑的微孔陣列，加裝PDMS環(huán)形外壁后組成微反應(yīng)器。測量、分析此實(shí)驗(yàn)平臺所生成微孔的誤差率，并測試微反應(yīng)器的密封性。(2)人脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng)的增殖、分化特

5、性及鑒定:對成品人脂肪干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)鑒定，檢測第1、3、6代細(xì)胞活性，觀察其形態(tài)變化、生長趨勢和活細(xì)胞比例，并繪制細(xì)胞生長曲線、計(jì)算群體倍增時(shí)間;檢測此三代細(xì)胞的表面抗原標(biāo)記是否存在差異;選取第3代細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)分化，并通過油紅O、茜素紅染色及成脂分化（PPAR-γ、β-Actin和C/EBPα）、成骨分化(OPN、OCN和AKP)特異性標(biāo)記物進(jìn)行鑒定，判斷其成脂、成骨分化能力。(3)利用通用型PDMS微孔陣列微反應(yīng)器研究空

6、間堆疊因素對人脂肪干細(xì)胞增殖、凋亡的影響:取第3代人脂肪干細(xì)胞配制成3×104/ml、6×104/ml、1×105/ml三種濃度單細(xì)胞懸液，分別接種于無微孔PDMS平面微反應(yīng)器、普通培養(yǎng)皿密閉培養(yǎng)區(qū)及具備直徑60μm、80μm、100μm和150μm微孔的微孔陣列微反應(yīng)器內(nèi)，選擇種植后24h、72h、120h和168h為采樣點(diǎn)，用光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡觀察細(xì)胞分布狀況并進(jìn)行形態(tài)學(xué)描述，再用激光掃描共聚焦顯微鏡對經(jīng)熒光染色細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分布、

7、細(xì)胞計(jì)數(shù)及凋亡計(jì)數(shù)檢測，確定能夠最終實(shí)現(xiàn)可控堆疊模型（單層組、1-2層組、2-3層組）的脂肪干細(xì)胞懸液濃度-微孔孔徑配比。(4)利用通用型PDMS微孔陣列微反應(yīng)器研究空間堆疊因素對人脂肪干細(xì)胞成脂、成骨分化傾向的影響:在前一實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇具備80μm、100μm和150μm直徑微孔的PDMS微孔陣列微反應(yīng)器，配制濃度為6×104/ml的脂肪干細(xì)胞單細(xì)胞懸液接種于微反應(yīng)器內(nèi)，形成三組具備不同堆疊層數(shù)（單層組、1-2層堆疊組、2-3層堆疊組

8、）的三維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組，接種后24h開始成脂和成骨誘導(dǎo)，于誘導(dǎo)后14d對微反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行油紅O和茜素紅染色，并于誘導(dǎo)后0d、7d、14d將微反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞消化后收集，分別對其成脂分化（PPAR-γ、β-Actin和C/EBPα）、成骨分化（OPN、OCN和AKP）特異性標(biāo)記物進(jìn)行定量分析，比較各時(shí)間點(diǎn)不同堆疊狀態(tài)對脂肪干細(xì)胞分化傾向性的影響。
　　結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)一:成功構(gòu)建高精度通用型PDMS微孔陣列微反應(yīng)器，各孔徑誤差率＜±0

9、.2％，微反應(yīng)器外壁與底面黏著良好無滲漏。(2)實(shí)驗(yàn)二:人脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng)具有穩(wěn)定且旺盛的生長能力，增殖能力強(qiáng)且穩(wěn)定，第1、3、6代細(xì)胞活細(xì)胞比例并無顯著性差異(p=0.108)，此三代細(xì)胞間群體倍增時(shí)間無顯著性差異(p=0.104);細(xì)胞表面標(biāo)記物符合間充質(zhì)干細(xì)胞特征，CD10、CD13、CD29、CD44、CD59、CD71和CD105呈現(xiàn)高表達(dá)，CD11b、CD14、CD18、CD34、CD45、CD56和HLA-DR呈現(xiàn)低表達(dá)

10、或無表達(dá)，且經(jīng)多次傳代后仍保持比例穩(wěn)定;經(jīng)體外成脂、成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞經(jīng)特異性染色鑒定（油紅O、茜素紅）及特異性標(biāo)記物表達(dá)檢測（成脂:PPAR-γ、β-Actin、C/EBPα，成骨:OPN、OCN和AKP），證實(shí)其具有分化為脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞的能力，且隨培養(yǎng)時(shí)間延長表達(dá)量顯著增高(p＜0.01)。(3)實(shí)驗(yàn)三:細(xì)胞在PDMS平面與普通培養(yǎng)皿表面培養(yǎng)并無明顯差異;利用PDMS微孔陣列可以構(gòu)建滿足實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要的細(xì)胞堆疊模型，人脂肪干細(xì)胞以6

11、×104/ml濃度接種時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)在150μm直徑微孔內(nèi)呈單層平鋪、100μm直徑微孔內(nèi)呈2層堆疊、80μm直徑微孔內(nèi)呈3層堆疊，微孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)在7d內(nèi)穩(wěn)定無顯著增減;60μm直徑微孔內(nèi)細(xì)胞量最少(p＜0.05)，且微孔內(nèi)細(xì)胞凋亡比例高于其他各組(p＜0.05);堆疊層數(shù)越高，細(xì)胞凋亡比例越高。(4)實(shí)驗(yàn)四:處于不同堆疊狀態(tài)的人脂肪干細(xì)胞其分化傾向存在差異，成脂分化傾向以單層組最高、2層堆疊次之、3層堆疊組最低(p＜0.05);成骨分化傾

12、向以2層堆疊最高、3層堆疊次之、單層組最低(p＜0.05);微反應(yīng)器內(nèi)特異性分化標(biāo)記物水平升高晚于純平面培養(yǎng)。
　　結(jié)論：本研究成功設(shè)計(jì)并制作出通用型PDMS微孔陣列微反應(yīng)器，其底板為大量排列整齊、誤差率極小的微米級微孔陣列，配合PDMS彈性外壁形成以微孔陣列區(qū)為中心的微反應(yīng)環(huán)境。
　　成品人脂肪干細(xì)胞具有基本一致的細(xì)胞表面標(biāo)記及免疫特征，不僅具有旺盛、持久的增殖活性，還能保證其細(xì)胞表面標(biāo)記經(jīng)過多代增殖后不發(fā)生顯著改變，更能

13、實(shí)現(xiàn)體外人工誘導(dǎo)下的成脂、成骨分化，滿足實(shí)驗(yàn)需求。
　　將此細(xì)胞群種植于PDMS微反應(yīng)器微孔陣列區(qū)內(nèi)，借助微米級平臺的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，結(jié)合對接種密度與微孔設(shè)計(jì)的調(diào)整，構(gòu)建了可控的細(xì)胞立體空間堆疊模型;同時(shí)，由于PDMS材質(zhì)的高透光性，能夠?qū)崿F(xiàn)對微孔內(nèi)細(xì)胞分布、增殖的無創(chuàng)性觀察;對微孔內(nèi)細(xì)胞經(jīng)過成脂、成骨誘導(dǎo)并進(jìn)行相關(guān)分化標(biāo)記物檢測，明確在不同堆疊狀態(tài)下標(biāo)記物表達(dá)水平。通過本實(shí)驗(yàn)，不僅收集了細(xì)胞堆疊平臺所需的基本數(shù)據(jù)（細(xì)胞接種濃度、微孔