血管內(nèi)皮生長因子對肌漿網(wǎng)鈣泵活性的影響及其對心肌梗死的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景及目的：VEGF-A是VEGF家族成員中最具有特征性的，其在組織和細(xì)胞中的含量最多，且功能最強(qiáng)。VEGF-A分為5種亞型，其中VEGF165是最為代表性、最為重要的同分異構(gòu)體。VEGF165主要調(diào)控其受體VEGFR2的表達(dá)，從而改善心肌纖維的重構(gòu)，AMI后VEGF通過結(jié)合VEGFR2來發(fā)揮其主要生物學(xué)作用。VEGF-A已被證實(shí)具有抗凋亡的作用，能維持新生血管及新生心肌細(xì)胞的穩(wěn)定性。
　　VEGF與VEGFR2結(jié)合后激活磷脂

2、酶C(phospholipase C,PLC)，進(jìn)而導(dǎo)致三磷酸肌醇(inositol1,4,5-triphosphate,IP3)的形成，IP3引發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。心肌細(xì)胞SERCA可將Ca2+泵回肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的濃度，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的舒縮性。SERCA的活性受胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+濃度調(diào)節(jié)，Ca2+濃度增加，SERCA的活性隨之增加。其與貯存蛋白結(jié)合并儲存，是一種自身調(diào)節(jié)機(jī)制。因此，我們猜測VEGF與SERCA之間

3、存在某種必然的聯(lián)系，其作用橋梁很可能同Ca2+相關(guān)。為驗(yàn)證這一猜想，我們研究了VEGF對SERCA活性的影響及其作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　首先培養(yǎng)293細(xì)胞，將重組腺病毒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞后擴(kuò)增純化，用綠色熒光蛋白標(biāo)記法測定腺病毒滴度。
　　將6周齡ICR小鼠隨機(jī)分為sham組，Ad-VEGF組，Ad-GFP組，SU5416組，然后對后三組采取結(jié)扎心臟冠狀動脈前降支法制備小鼠心肌梗死模型并分別心肌注射Ad-VEGF，Ad

4、-GFP，SU5416（VEGFR2阻斷劑），sham組除為結(jié)扎前降支外，余處理與另外三組相同：
　　1.通過心電圖檢測模型構(gòu)建是否成功。
　　2.分別于術(shù)后7天、14天檢測小鼠超聲心動圖以了解各組小鼠的心功能是否有區(qū)別。
　　3.麻醉取心臟后，取其右后肢脛骨裸骨后測其長度。
　　4.ELISA法檢測血清Tn-I水平。
　　5.比色法測SERCA活性。
　　6.利用蛋白免疫印記法（Western bl

5、ot）檢測VEGF，PLN，P-T17PLN，P-S16PLN，SERCA，HAX-1在各組心肌組織中的表達(dá)。
　　7.HE染色檢測心肌纖維化情況。
　　8.馬松三色染色（Masson）測心梗面積。
　　9.Tunnel法測心臟組織凋亡。
　　結(jié)果：
　　1.心梗術(shù)后小鼠各導(dǎo)聯(lián)ST段（ST segment）弓背向上抬高。
　　2.小鼠心梗后心功能降低，VEGF能夠提高心梗后心功能，阻斷VEGF受體后心

6、功能降低。
　　3.心梗術(shù)后，心肌受損，注射了Ad-VEGF的小鼠能在短期內(nèi)使梗死邊緣區(qū)心肌更好的再生，有助于提升心功能，降低心衰發(fā)生率，改善預(yù)后。
　　4.Tn-I檢測驗(yàn)證了心梗造模的成功，并且VEGF可以降低Tn-I水平，使其更早的降至正常，而阻斷VEGF受體后，Tn-I水平升高。
　　5.VEGF提高心梗后肌漿網(wǎng)鈣泵活性，阻斷VEGF受體后，活性降低。
　　6.由蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，心梗后心肌梗死邊緣

7、區(qū)VEGF表達(dá)增加，轉(zhuǎn)染VEGF的小鼠，VEGF表達(dá)量增加更明顯，比其他心梗組多1倍，Ad-VEGF轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞成功。VEGF降低PLN與SERCA2a蛋白表達(dá)量的比值，升高P-T17PLN與PLN的比值，升高P-S16PLN與PLN的比值。VEGF與HAX-1蛋白的表達(dá)量增加有相關(guān)性。
　　7.心臟病理切片HE染色說明VEGF組心梗面積（myocardium infarct size MIS）小于其他心梗組。
　　8.心臟