基于抗氧化和促造血雙重調(diào)控作用研究雞血藤及其活性單體兒茶素的抗輻射機制.pdf

1、雞血藤為豆科(Leguminosae)密花豆屬（Spatholobus）植物密花豆（Spatholobus suberectus）的干燥藤莖，具有活血補血，調(diào)經(jīng)止痛，舒經(jīng)活絡(luò)之功效，臨床主要用于治療月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)閉經(jīng)，風(fēng)濕痹痛，麻木癱瘓，血虛萎黃等癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明，雞血藤還具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。目前，雞血藤中發(fā)現(xiàn)的化合物結(jié)構(gòu)類型主要有黃酮類、甾醇類、內(nèi)酯類、蒽醌類、萜類、苷類及其他類型化合物。課題組

2、前期采用血清藥理學(xué)的方法，對從雞血藤乙酸乙酯部位分離得到的9種單體化合物進行了篩選，發(fā)現(xiàn)兒茶素刺激造血祖細胞增殖活性最強。
　　輻射可造成機體血液、免疫、消化、生殖等系統(tǒng)的損害，累及多個器官和臟器。對于輻射危害的機理，目前認為，一是輻射可直接導(dǎo)致多種DNA損傷，造成基因突變和染色體畸變等;二是使機體產(chǎn)生大量高活性的、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的氧自由基(ROS)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，損傷組織器官。骨髓為輻射的高敏感組織，輻射造成的造血干細胞大量凋

3、亡甚至死亡是外周血象降低的主要原因。因此，降低氧自由基對機體的破壞，促進機體造血能力的提高是治療輻射損傷的重點。雞血藤有抗氧化和促造血的藥理作用，所以本課題從抗氧化和促造血雙重調(diào)控作用來研究雞血藤及其活性單體兒茶素的抗輻射機制。
　　本論文內(nèi)容主要分為四部分，首先，采用亞急性輻射損傷小鼠模型，測定給藥28天內(nèi)小鼠體重、外周血象(WBC、RBC、PLT、HGB)和免疫臟器指數(shù)（脾臟、胸腺）等指標的變化，觀察雞血藤醇提物及其活性單體兒

4、茶素對輻射損傷小鼠的保護作用，確定最佳給藥劑量組以及外周血象改變最顯著的時間點進行下一步作用機制研究。其次，通過測定模型小鼠血清和肝臟中氧自由基(ROS)、脂質(zhì)過氧化物(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、還原性谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)活力，研究雞血藤醇提物和兒茶素的抗氧化作用及機制。然后，通過給藥后模型小鼠的骨髓病理學(xué)變化，造血祖細胞集落形成能力，考察雞血藤醇提物及兒茶素的促造血作用;通過對G-CSF依賴的NFS-60細胞

5、增殖和小鼠骨髓細胞中JAK-STAT通路關(guān)鍵蛋白磷酸化的影響研究其促造血作用機制。最后，利用流式細胞儀測定雞血藤醇提物和兒茶素對模型小鼠骨髓細胞凋亡的影響，并通過Western Blotting和免疫組化法檢測骨髓中凋亡相關(guān)蛋白的表達來研究其抗凋亡機制。
　　本課題研究發(fā)現(xiàn):小鼠經(jīng)6.0Gy60Coγ射線一次性全身照射后，進食減少，皮毛散亂，活動度降低，體重在給藥前七天一直處于較低水平;外周血象(WBC、RBC、PLT、HGB)水

6、平均有不同程度下降，其中WBC降低最顯著;免疫器官胸腺和脾臟指數(shù)在28天內(nèi)一直顯著低于正常組。每日灌胃給予不同劑量雞血藤醇提物和兒茶素后，小鼠的狀態(tài)和體重都有改善;外周血象的恢復(fù)速度加快，給藥組從Day7開始與模型組比逐漸有顯著性差異;給藥組胸腺和脾臟指數(shù)在Day7和Day28均顯著高于模型組。其中，雞血藤醇提物高劑量組（生藥40g/kg）和兒茶素高劑量組(200mg/kg)各項指標改善效果最好，因此，選擇該劑量在血象恢復(fù)的Day7作為

7、切入點進行抗氧化、促造血、抗凋亡作用及機制研究。
　　抗氧化作用的研究發(fā)現(xiàn)，輻射可使小鼠血清和肝臟的ROS和MDA含量升高，SOD和GSH-Px活力降低，雞血藤醇提物和兒茶素均能通過提高抗氧化酶SOD和GSH-Px活力，減少有害脂質(zhì)過氧化物MDA生成，使ROS含量減少，發(fā)揮抗氧化作用，降低輻射損傷。
　　促造血作用及機制的研究發(fā)現(xiàn)，雞血藤醇提物和兒茶素可增加模型小鼠骨髓細胞數(shù)量，減輕骨髓損傷;促進骨髓造血祖細胞CFU-GM、

8、BFU-E和CFU-Mix集落的形成;提高骨髓蛋白中JAK2、STAT5a和STAT5b的磷酸化水平，激活造血因子受體相關(guān)JAK-STAT信號通路，促進造血。體外實驗表明，雞血藤醇提物和兒茶素可促進G-CSF依賴的NFS-60細胞的增殖，其促增殖作用機制并不是增加細胞內(nèi)G-CSF的含量，而是與提高G-CSF受體的表達，激活G-CSF受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。
　　抗凋亡作用及機制的研究發(fā)現(xiàn)，雞血藤醇提物和兒茶素可降低模型小鼠骨髓細胞的

9、凋亡率。Western Blotting和免疫組化結(jié)果顯示，雞血藤醇提物和兒茶素可使小鼠骨髓中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達上調(diào)，Cleaved Caspase-3和Bax的表達下調(diào)，其中雞血藤醇提物下調(diào)相關(guān)蛋白的表達更顯著，這與雞血藤醇提物組骨髓細胞凋亡率更低的結(jié)果相一致。
　　綜上所述，雞血藤醇提物和兒茶素可以通過提高機體的抗氧化酶活力，降低輻射造成的ROS劇增，從而保護骨髓造血干/祖細胞，一方面提高其數(shù)量，改善造血微環(huán)境，另一方