法舒地爾對UUO大鼠模型IKKβ、IκBα、NF-κBP65及Ⅲ型膠原表達(dá)的影響.pdf

1、目的：腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾?。–hronic Kidney Disease，CKD）進(jìn)行性進(jìn)展的共同病理基礎(chǔ)，其病理學(xué)變化是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過多沉積，進(jìn)而導(dǎo)致腎結(jié)構(gòu)的破壞及腎功能的下降。多種細(xì)胞、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞因子均參與該過程。腎間質(zhì)纖維化的早期表現(xiàn)為以巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞因子、趨化因子增加為主的炎癥狀態(tài)。在炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子、生長因子及趨化因子

2、及均可作用于成纖維細(xì)胞（fibroblasts,FB）引起 FB增生活躍以及誘導(dǎo)其發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，使其合成膠原蛋白能力增加，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，造成腎臟結(jié)構(gòu)重塑，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一種很重要的轉(zhuǎn)錄因子，在各種細(xì)胞外刺激介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控中起核心作用，研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子、生長因子及趨化因子的基因表達(dá)是通過該因子轉(zhuǎn)錄機(jī)制來調(diào)節(jié)的，在腎間質(zhì)纖維化過程中，能促進(jìn)多種細(xì)胞因子

3、、生長因子及趨化因子的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而作用于FB，介導(dǎo)和促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展。NF-κB的活化主要依賴于經(jīng)典途徑：這種途徑依賴IKK（IκB kinase）多聚體磷酸化IκBα(NF-κB抑制蛋白)，再通過泛素化降解IκBα，使NF-κB二聚體得以釋放，核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，啟動下游基因轉(zhuǎn)錄，TNF-α等促炎細(xì)胞因子可激活此途徑。IKK是一個大的多組分蛋白激酶復(fù)合體（＞700KDa），它包括四個組分，即具有催化活性的IKKα/IKK1

4、、IKKβ/IKK2，和兩個輔助蛋白IKKγ/NEMO、IKAP。其中IKKβ是激活NF-κB經(jīng)典途徑的關(guān)鍵亞基，IKKβ可以使IκBα上Ser32和Ser36磷酸化，并誘導(dǎo)其降解，使NF-κB從復(fù)合體中解離后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核啟動下游基因轉(zhuǎn)錄。法舒地爾是一種新型異喹啉磺胺衍生物，是目前應(yīng)用于臨床的 Rho激酶抑制劑，其具有擴(kuò)張血管、減少炎癥反應(yīng)、抑制自由基生成等作用，目前廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療。有研究顯示：腎間質(zhì)纖維化中，法舒地爾作為

5、Rho激酶抑制劑通路阻斷Rho-ROCK通路對腎間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用已被研究，有研究顯示其作為異喹啉類抑制劑作用于激酶催化結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點發(fā)揮作用，對其它蛋白激酶也具有選擇性抑制作用，但報道不多，本實驗?zāi)康氖峭ㄟ^建立單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型(unilateral ureteral obstruction,UUO)，并應(yīng)用法舒地爾進(jìn)行干預(yù)觀察其對IKKβ、IκBα、NF-κBP65、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響，探討法舒地爾保護(hù)腎臟，延緩腎間質(zhì)

6、纖維化的可能機(jī)制，為延緩及治療腎間質(zhì)纖維化提供新的靶點。
　　方法：將54只SPF級雄性SD大鼠(體重180g±20g)編號后按照隨機(jī)原則分為三組：A組(假手術(shù)組，正常對照組)，B組(單側(cè)輸尿管結(jié)扎組，模型組)，C組(法舒地爾組，治療組)，每組各18只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行手術(shù)建立單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型，術(shù)前12小時各組大鼠禁食水。三組大鼠均于術(shù)前1天開始給藥,C組給予法舒地爾注射液10mg/（Kg·d）腹腔注射；A組及 B組每天

7、給予等容積的0.9％氯化鈉注射液腹腔注射。自由攝食水，分別于術(shù)后第3、7、14天處死6只大鼠，留取左腎標(biāo)本，0.9%生理鹽水充分沖洗后取中間1/4固定于4%多聚甲醛中，用于病理切片，應(yīng)用HE和Masson染色技術(shù)觀察光鏡下大鼠腎組織病理改變及腎間質(zhì)纖維化程度，并應(yīng)用免疫組化技術(shù)測定IKKβ、IKBα、NF-KBP65及Ⅲ型膠原在腎臟組織中的表達(dá)。另取部分腎臟組織放入液氮并轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存，用于行western blot檢測

8、NF-κBP65蛋白的表達(dá)。所得實驗數(shù)據(jù)用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示統(tǒng)計結(jié)果，應(yīng)用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05表示結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠腎臟組織病理學(xué)改變
　　1.1 肉眼
　　A組腎臟顏色及大小正常，其余各組大鼠腎臟體積均有不同程度增大，輸尿管擴(kuò)張，腎皮質(zhì)變薄，腎臟及輸尿管內(nèi)有尿液積聚，其中以B組腎臟病變最為明顯。
　　1.

9、2 光鏡下HE染色
　　A組：腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管及間質(zhì)未見明顯異常。B組：術(shù)后第3天，少量炎癥細(xì)胞局部浸潤于腎間質(zhì)區(qū)域，腎小管輕度擴(kuò)張，無明顯纖維組織異常增生；第7天，腎間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管擴(kuò)張明顯，并可見腎小管萎縮、塌陷，纖維組織異常增生；第14天，可見更多腎小管萎縮，基底膜完整性破壞。C組：術(shù)后隨時間延長，腎小管間質(zhì)病變逐漸加重，和同期B組相比，腎小管間質(zhì)病變程度有所減輕，但仍明顯重于同期A組。
　　1.3

10、 光鏡下Masson染色
　　A組：腎組織相對完整，僅個別區(qū)域有少量膠原纖維。B組：術(shù)后第3天可見腎小管輕度擴(kuò)張，腎間質(zhì)可見少量藍(lán)色膠原纖維沉積，相較于同期A組增多；術(shù)后第7天，腎小管擴(kuò)張明顯，并可見萎縮腎小管，藍(lán)色膠原纖維沉積較術(shù)后3天增多；術(shù)后14天可觀察到藍(lán)色膠原纖維沉積明顯，并且相互交織成網(wǎng)狀。C組：術(shù)后隨時間延長，腎小管間質(zhì)病變及膠原纖維表達(dá)水平進(jìn)行性加重、增多，較同期 B組的病變程度稍輕，但仍明顯重于A組。
　　

11、2.免疫組化結(jié)果
　　顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，IKKβ、IκBα、NF-κBP65、Ⅲ型膠原在各組腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)呈陽性表達(dá)，其中NF-κBP65在分析中均針對細(xì)胞核中因子的表達(dá)變化。由圖像分析結(jié)果可見 B組 IKKβ、NF-κBP65、Ⅲ型膠原在術(shù)后3天、7天、14天在腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)表達(dá)量逐漸增加（P均<0.05），各因子分別與同期A組相比表達(dá)增加（P均<0.05）；B組IκBα隨梗阻時間延長，在腎間質(zhì)表達(dá)量逐漸減少（P

12、均<0.05），與同期A組相比表達(dá)減少（P均<0.05）。C組IKKβ、NF-κBP65、Ⅲ型膠原在腎間質(zhì)表達(dá)隨時間延長也逐漸增加（P均<0.05），分別與同期B組相比各因子表達(dá)減少（P均<0.05），但與同期A組相比，表達(dá)增加（P均<0.05）；C組IκBα在腎間質(zhì)表達(dá)隨梗阻時間延長逐漸減少（P均<0.05），與同期B組相比各因子表達(dá)增多（P均<0.05），與同期A組比較，表達(dá)減少（P均<0.05）
　　3.western Bl

13、ot結(jié)果
　　NF-κBP65蛋白：B組目的蛋白的表達(dá)量隨時間延長逐漸增加（P均<0.05），與同期A組相比表達(dá)量增加（P均<0.05）；C組術(shù)后各時期目的蛋白表達(dá)量隨時間延長逐漸增加（P均<0.05），與同期B組相比較表達(dá)量減少（P均<0.05），但仍高于同期A組（P均<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.IKKβ、NF-κBP65、Ⅲ型膠原在UUO模型梗阻側(cè)腎臟組織中的表達(dá)量增加，且與時間延長呈正相關(guān)，而IκBα呈相