FIRS早產(chǎn)兒臍血MMP-9、TIMP-1水平變化及其與心肺損傷關(guān)系的研究.pdf

1、胎兒炎癥反應(yīng)綜合征（fetal inflammatory response syndrome，F(xiàn)IRS）是指胎兒免疫系統(tǒng)被激活釋放大量致炎因子而導(dǎo)致的一種亞臨床狀態(tài)，是全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）在胎兒期的特殊表現(xiàn)形式，與早產(chǎn)密切相關(guān)，是除窒息外又一重要臟器損傷因素，常累及肺、心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道、腎臟、皮膚等重要臟器。隨著生殖醫(yī)學(xué)飛速發(fā)展，產(chǎn)、兒科

2、診療水平不斷提升，近年來早產(chǎn)兒的出生率上升至5％~15%，早產(chǎn)兒乃至超早產(chǎn)兒數(shù)量明顯增多，故其存活及轉(zhuǎn)歸成為國內(nèi)外學(xué)者研究關(guān)注的熱點(diǎn)，其中心肺損傷是引發(fā)死亡及預(yù)后欠佳的重要病因，F(xiàn)IRS與心肺損傷的關(guān)系也逐漸引起關(guān)注。
　　支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）及心肌損傷是早產(chǎn)兒心肺損傷的代表性疾病，均與FIRS關(guān)系密切。BPD是早產(chǎn)兒、尤其是超早產(chǎn)兒呼吸系統(tǒng)常見病，鑒于其獨(dú)特的起病方式、

3、臨床及影像學(xué)表現(xiàn)，被國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注，是致死的重要病因之一，亦是嬰兒期慢性呼吸系統(tǒng)疾病的主要因素及兒童期哮喘的誘因之一。資料顯示，存在炎癥反應(yīng)的極低出生體重兒，其肺泡灌洗液中IL-1、IL-6等炎性細(xì)胞因子濃度上升，更易發(fā)生BPD；國外亦有研究顯示在70例BPD患兒中，胎兒炎癥反應(yīng)的發(fā)生率高達(dá)76%。心肌損傷起病隱匿，臨床表現(xiàn)多樣，早期無特異性預(yù)測(cè)指標(biāo)，容易漏診，以致延遲治療、預(yù)后不良，該病在早產(chǎn)兒中發(fā)病率約30%左右，而在FIRS早產(chǎn)

4、兒中可上升至46.8%，其中致心律失常發(fā)生率約4.28%，死亡率約0.6%~1%。
　　雖前期研究提示FIRS可引起心肺損傷，但其具體機(jī)制仍未探究清楚，這也使得探尋心肺損傷的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)及新型治療方法遇到障礙，因此探究FIRS引起心肺損傷的發(fā)病機(jī)制尤為必要。
　　FIRS與SIRS在疾病發(fā)生及病情進(jìn)展中存在諸多相似之處，在SIRS的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-8等炎性細(xì)胞因子與基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallo

5、proteinases，MMP-9）協(xié)同作用，加重炎癥反應(yīng)的同時(shí)促進(jìn)MMP-9分泌，造成并加重臟器炎癥損傷。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶（ matrix metalloproteinases，MMPs）中明膠酶家族的重要成員，與其抑制劑基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP-1）在多器官的發(fā)育與重建發(fā)揮重要作用，其在肺發(fā)育各個(gè)階段均有表達(dá)，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中MMP-9受

6、輻射、高氧等影響而表達(dá)上調(diào)時(shí)，引發(fā)肺泡損傷及肺纖維化。I、III型膠原纖維是心臟膠原的主要組成纖維，此外還包括少量IV型膠原纖維，MMP-9亦可參與心臟膠原纖維的代謝，當(dāng)MMP-9表達(dá)上調(diào)，可引起心臟膠原纖維代謝紊亂，造成心肌損傷，甚至心室壁變薄、心功能下降。
　　本課題研究：FIRS的發(fā)生是否會(huì)引起 MMP-9的過度表達(dá)及MMP-9/TIMP-1比值的紊亂；MMP-9、TIMP-1水平的改變是否是 FIRS引發(fā)心肺損傷的機(jī)制之一

7、；MMP-9能否成為預(yù)測(cè)心肺損傷早期臨床指標(biāo)并為治療提供線索。
　　目的：
　　1臨床實(shí)驗(yàn)部分：
　　1.1通過檢測(cè)FIRS早產(chǎn)兒與對(duì)照組早產(chǎn)兒臍血MMP-9、TIMP-1水平，探究FIRS早產(chǎn)兒臍血MMP-9、TIMP-1水平的變化；
　　1.2探究FIRS早產(chǎn)兒臍血IL-6水平與MMP-9、TIMP-1水平及二者比值（以下簡稱M/T）的相關(guān)性，以期進(jìn)一步闡明FIRS病程中IL-6與MMP-9是否存在協(xié)同關(guān)系，

8、以致進(jìn)一步加重炎癥損傷；
　　1.3動(dòng)態(tài)隨訪各組病情進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸，確定研究對(duì)象中 BPD及心肌損傷的發(fā)生情況，探討FIRS及MMP-9、TIMP-1變化與心肺損傷的關(guān)系。
　　2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分：
　　2.1通過建立 FIRS昆明小鼠模型，觀察 FIRS鼠心肺組織病理改變及MMP-9、TIMP-1表達(dá)變化，研究兩者表達(dá)改變與心肺損傷關(guān)系，探究MMP-9過度表達(dá)是否是FIRS引發(fā)心肺損傷的機(jī)制之一；
　　2.2通過觀察F

9、IRS模型在MMP-9抑制劑干預(yù)下心肺組織病理變化，探究下調(diào)MMP-9表達(dá)對(duì)心肺發(fā)育的保護(hù)作用；
　　2.3綜合臨床實(shí)驗(yàn)及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，展望MMPs抑制劑應(yīng)用對(duì)胎兒及早產(chǎn)兒早期心肺損傷的改善作用。
　　方法：
　　1臨床實(shí)驗(yàn)部分
　　1.1研究對(duì)象及分組
　　選取2014.5-2015.12于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院及第二醫(yī)院出生的早產(chǎn)兒，排除神經(jīng)系統(tǒng)或者其他系統(tǒng)嚴(yán)重畸形或是罹患遺傳代謝性疾病的患兒、母親在分娩

10、前存在妊娠合并非感染疾?。ㄈ焉锖喜⒎尾考膊?、心臟病、糖尿病、子癇以及貧血等）的患兒、以及存在產(chǎn)傷或分娩中發(fā)生窒息缺氧的患兒。共采集病例118例。根據(jù)FIRS診斷標(biāo)準(zhǔn)及胎齡分為四組：對(duì)照組1（胎齡≤32周，非FIRS）：25例；對(duì)照組2（32周＜胎齡＜37周，非FIRS）：32例；實(shí)驗(yàn)組1（胎齡≤32周，F(xiàn)IRS）：33例；實(shí)驗(yàn)組2（32周＜胎齡＜37周，F(xiàn)IRS）：28例。
　　1.2標(biāo)本留取及制備
　　入組早產(chǎn)兒生后即斷臍

11、，從胎兒端留取臍靜脈血2~3ml，離心后收集血清；于產(chǎn)中采取羊水2~3ml，離心后收集上清液，均-80℃保存待檢。胎盤一經(jīng)娩出即在相對(duì)無菌條件下采集胎盤、臍帶、胎膜等組織并置于中性甲醛溶液中，保存在4℃冰箱中待檢。
　　1.3實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定
　　1.3.1采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的方法檢測(cè)臍血中的IL-6、MMP-9、TIMP-1水

12、平；免疫比濁法測(cè)定羊水 CRP；瑞氏染色觀察羊水涂片；蘇木精-伊紅（ hematoxylin-eosin，HE）染色觀察胎盤組織病變。
　　1.3.2動(dòng)態(tài)隨訪研究對(duì)象，隨訪時(shí)間≥1月，明確隨訪對(duì)象是否發(fā)生BPD、心肌損傷，并分別記錄疾病發(fā)生例數(shù)，計(jì)算研究對(duì)象中疾病發(fā)生率。
　　2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分
　　2.1模型制備
　　制備昆明小鼠（KM小鼠）孕鼠30只，隨機(jī)分為3組（n=10只），分別為：對(duì)照組（control g

13、roup）、FIRS組（FIRS group）、FIRS干預(yù)組（RA group）。借鑒Samuli Rounioja[1]等人FIRS模型制備方法：孕15日（G15d）將FIRS組及FIRS干預(yù)組孕鼠羊膜囊內(nèi)注射LPS（0.25ug-2.5ug/sac，總量不超過100ug/Kg），采用同樣方法將對(duì)照組孕鼠羊膜囊內(nèi)注射等體積生理鹽水（normal saline，NS）。FIRS干預(yù)組在孕17日（G17d）開始MMP-9抑制劑-維甲酸（

14、retinoic acid，RA）（50ug/Kg）腹腔注射，直至生產(chǎn)。
　　2.2標(biāo)本留取
　　分別從對(duì)照組、FIRS組及 FIRS干預(yù)組中各隨機(jī)取3只孕齡19日（G19d）孕鼠，行剖宮產(chǎn)手術(shù)，留取胎鼠的胎盤及心肺組織，余孕鼠等待自然分娩，均保留存活新生鼠。于生后第1、3、7、14天（P1.3.7.14d）分別處死三組小鼠（每組每時(shí)間點(diǎn)8只），留取心肺組織，將所有留取的組織分為兩份，一份置于中性甲醛溶液中固定后石蠟包埋用于

15、HE染色，另一份液氮速凍后置-80℃用以實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（ real-time PCR， RT-PCR）。
　　2.3實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)
　　2.3.1觀察各組孕鼠手術(shù)后生命活動(dòng)，記錄流產(chǎn)數(shù)、死產(chǎn)數(shù)及新生鼠死亡數(shù)，密切觀察新生鼠生命活動(dòng)；
　　2.3.2測(cè)量各組胎鼠、新生鼠體重、肺重，計(jì)算肺指數(shù)（肺重/體重）；
　　2.3.3通過HE染色觀察各組胎盤及胎鼠、新生鼠心肺組織的病理變化；
　　2.3.4通過HE染

16、色觀察各組新生鼠肺泡輻射計(jì)數(shù)（alveolar radiation count， RAC）變化；
　　2.3.5采用 RT-PCR檢測(cè)各組胎鼠、新生鼠心肺組織中 IL-6、MMP-9、TIMP-1的相對(duì)表達(dá)量。
　　3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(-X)±S）表示，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）

17、（M（Q））表示，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示。
　　計(jì)量資料：符合正態(tài)分布的兩組均數(shù)的比較采用成組t檢驗(yàn)（t-test）；正態(tài)分布及方差齊多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析（ One-way ANOVA），組間多重比較采用SNK法（Student-Newman-Keuls）；偏態(tài)分布數(shù)據(jù)多組比較采用Kruskal-wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用 Spearman’s線性相關(guān)。計(jì)數(shù)資料

18、：兩組資料比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。
　　結(jié)果：
　　1臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.1早產(chǎn)兒臍血IL-6、MMP-9、TIMP-1水平變化
　　1.1.1 FIRS早產(chǎn)兒臍血IL-6、MMP-9、TIMP-1水平變化（組間比較）
　　胎齡＜32周的 FIRS早產(chǎn)兒臍血 IL-6、MMP-9、TIMP-1及 M/T（MMP-9/TIMP-1比值）水平均明顯高于同胎齡對(duì)照組（P＜0.01）；
　

19、　胎齡＞32周的 FIRS早產(chǎn)兒臍血 IL-6、MMP-9、TIMP-1及 M/T（MMP-9/TIMP-1比值）水平均明顯高于同胎齡對(duì)照組（P＜0.01）。
　　1.1.2不同胎齡早產(chǎn)兒臍血IL-6、MMP-9、TIMP-1水平變化（組內(nèi)比較）
　　在FIRS早產(chǎn)兒中：胎齡＜32周者IL-6水平明顯高于胎齡＞32周者（P＜0.05），而MMP-9、TIMP-1及M/T水平與胎齡＞32周者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；

20、>　　在對(duì)照組中：胎齡＜32周者IL-6水平與胎齡＞32周者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而MMP-9、TIMP-1水平明顯低于胎齡＞32周者（P＜0.01）， M/T明顯高于胎齡＞32周者（P＜0.01）。
　　1.1.3 FIRS早產(chǎn)兒臍血IL-6與MMP-9、TIMP-1、M/T相關(guān)性分析
　　FIRS早產(chǎn)兒臍血 IL-6與 MMP-9呈正相關(guān)（ PMMP-9＜0.01， rMMP-9=0.875）；IL-6與TIMP

21、-1呈正相關(guān)（PTIMP-1＜0.01，rTIMP-1=0.874）；IL-6與M/T呈正相關(guān)（PM/T＜0.01，rM/T=0.745）。
　　1.2 FIRS患兒胎盤病理改變
　　實(shí)驗(yàn)組胎盤組織與對(duì)照組相比存在炎性浸潤，炎性細(xì)胞聚集：急性炎癥組織可見大量中性粒細(xì)胞聚集，組織充血、水腫；慢性炎癥組織可見中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤，組織可見壞死及增生；絨毛膜羊膜炎病變多集中在絨毛膜部位，可見中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞

22、及單核細(xì)胞等急慢性炎細(xì)胞浸潤。對(duì)照組胎盤組織正常。
　　1.3 FIRS患兒羊水涂片改變
　　實(shí)驗(yàn)組羊水涂片與對(duì)照組相比：可見炎細(xì)胞聚集，多以中性粒細(xì)胞為主，也可見淋巴細(xì)胞聚集。對(duì)照組涂片以脫落的上皮細(xì)胞為主，含少許雜質(zhì)。
　　1.4早產(chǎn)兒BPD及心肌損傷發(fā)病率的改變
　　1.4.1 FIRS早產(chǎn)兒BPD及心肌損傷發(fā)病率的改變（組間比較）
　　胎齡＜32周FIRS早產(chǎn)兒BPD及心肌損傷的發(fā)生率均高于同胎齡對(duì)

23、照組（P＜0.05）；
　　胎齡＞32周 FIRS早產(chǎn)兒心肌損傷的發(fā)生率明顯高于同胎齡對(duì)照組（P＜0.05），而BPD的發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　1.4.2不同胎齡早產(chǎn)兒BPD及心肌損傷發(fā)病率的改變（組內(nèi)比較）
　　在FIRS早產(chǎn)兒中：胎齡＜32周者BPD發(fā)生率明顯高于胎齡＞32周者（P＜0.01），心肌損傷的發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；
　　在對(duì)照組中胎齡＜32周者BPD及心肌損傷發(fā)生率

24、較胎齡＞32周者均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　2.1孕鼠圍產(chǎn)期情況及胎鼠、新生鼠存活情況
　　制備KM小鼠孕鼠30只，孕15日在羊膜囊內(nèi)分別注射LPS和NS處理，注藥后無孕鼠死亡事件發(fā)生；注藥48小時(shí)內(nèi)FIRS組出現(xiàn)2例陰道流血后流產(chǎn)事件，F(xiàn)IRS干預(yù)組出現(xiàn)1例陰道流血后流產(chǎn)事件，對(duì)照組無流產(chǎn)事件發(fā)生，流產(chǎn)率為10%（3/30）。去除流產(chǎn)孕鼠，余孕鼠一般情況可，生理活動(dòng)正常。
　　孕鼠

25、分娩情況：對(duì)照組共獲97（97/98）只胎鼠和64（64/65）只新生鼠，F(xiàn)IRS組共67（67/79）只胎鼠和33（33/42）只新生鼠，F(xiàn)IRS干預(yù)組共82（82/87）只胎鼠和46（46/52）只新生鼠。將剖宮產(chǎn)及順產(chǎn)娩出的胎盤進(jìn)行病理檢查，胎盤組織存在炎性浸潤者認(rèn)為制模成功，本實(shí)驗(yàn)制模成功率83.73%（139/166）。
　　2.2不同日齡FIRS鼠體重、肺重及肺指數(shù)的變化
　　FIRS發(fā)生后，19日齡胎鼠及1、7

26、、14日齡新生鼠肺重較同日齡對(duì)照組明顯減輕（P＜0.05）；19日齡胎鼠及1日齡新生鼠體重較同日齡對(duì)照組明顯減輕（P＜0.05）；19日齡胎鼠及1、7日齡新生鼠肺指數(shù)較同日齡對(duì)照組明顯降低（P＜0.05）。
　　當(dāng)RA干預(yù)后，僅19日齡胎鼠及1日齡新生鼠較對(duì)同日齡對(duì)照組肺重明顯減輕（P＜0.01）、且該日齡胎鼠及新生鼠較同日齡FIRS組肺重明顯增加（P＜0.01）；僅19日齡胎鼠體重較同日齡對(duì)照組減輕（P＜0.01）、且該日齡胎鼠

27、較同日齡FIRS組體重明顯增加（P＜0.01）；僅19日齡胎鼠及1日齡新生鼠肺指數(shù)較同日齡對(duì)照組明顯降低（P＜0.01）、且該日齡胎鼠及新生鼠較同日齡FIRS組肺指數(shù)明顯升高（P＜0.01）。
　　本實(shí)驗(yàn)中各組肺重、體重均隨日齡不斷增加，F(xiàn)IRS組肺重、體重發(fā)育整體落后于對(duì)照組，RA干預(yù)后好轉(zhuǎn)，肺指數(shù)在生后14日達(dá)到最低。
　　2.3 FIRS鼠胎盤及心肺組織病理改變
　　2.3.1胎盤組織：FIRS組與對(duì)照組病理比較

28、：胎盤組織可見大量炎細(xì)胞浸潤，絨毛結(jié)構(gòu)消失，可見水腫部分纖維化。
　　2.3.2肺組織：FIRS組與對(duì)照組病理比較：FIRS組肺泡數(shù)目減少，肺泡間隔減少、增厚，間質(zhì)部分及肺泡內(nèi)可見少量出血，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞；FIRS干預(yù)組與FIRS組病變相似，程度明顯減輕。
　　2.3.3心臟組織：FIRS組與對(duì)照組病理比較：FIRS組心肌組織可見出血灶及水腫，心室壁變薄；FIRS干預(yù)組與FIRS組病變相似，程度明顯減輕。
　　2.4

29、不同日齡FIRS鼠RAC的變化
　　發(fā)生FIRS后，7、14日齡新生鼠RAC較同日齡對(duì)照組明顯減少（P＜0.01）；
　　RA干預(yù)后，7、14日齡新生鼠RAC仍較同日齡對(duì)照組明顯減少（P＜0.01）、但較同日齡FIRS組明顯增加（P＜0.01）。
　　隨日齡增長，各組RAC不斷增加，F(xiàn)IRS組肺泡發(fā)育整體落后于對(duì)照組，RA干預(yù)后好轉(zhuǎn)，本實(shí)驗(yàn)中14日齡RAC值最高。
　　2.5不同日齡FIRS鼠心肺組織IL-6、M

30、MP-9、TIMP-1表達(dá)水平變化
　　2.5.1心臟：
　　發(fā)生FIRS后：19日齡胎鼠及1、7、14日齡新生鼠IL-6、MMP-9表達(dá)水平及M/T比值均明顯高于同日齡對(duì)照組（P＜0.05）。
　　RA干預(yù)后：19日齡胎鼠及1、7、14日齡新生鼠IL-6、MMP-9表達(dá)水平及 M/T比值仍明顯高于同日齡對(duì)照組（P＜0.05），但該日齡新生鼠MMP-9表達(dá)水平及M/T比值則明顯低于同日齡FIRS組（P＜0.01）。

31、r>　　2.5.2肺臟：
　　發(fā)生FIRS后：19日齡胎鼠及1、7、14日齡新生鼠IL-6、MMP-9表達(dá)水平及M/T比值均明顯高于同日齡對(duì)照組（P＜0.05）。
　　RA干預(yù)后：19日齡胎鼠及1、7、14日齡新生鼠IL-6、MMP-9表達(dá)水平及 M/T比值仍明顯高于同日齡對(duì)照組（P＜0.05），但該日齡胎鼠及新生鼠 MMP-9表達(dá)水平及 M/T比值則明顯低于同日齡 FIRS組（P＜0.01）。
　　2.6 FIRS鼠

32、心肺組織IL-6與MMP-9、TIMP-1及M/T的相關(guān)性分析
　　2.6.1心臟：IL-6與MMP-9呈正相關(guān)（PMMP-9＜0.01，rMMP-9=0.705）；IL-6與M/T呈正相關(guān)（PM/T＜0.01，rM/T=0.496）；IL-6與TIMP-1無線性關(guān)系（PTIMP-1=0.207，rTIMP-1=0.229）。
　　2.6.2肺臟：IL-6與MMP-9呈正相關(guān)（PMMP-9＜0.01，rMMP-9=0.551

33、）；IL-6與M/T呈正相關(guān)（PM/T＜0.01，rM/T=0.369）；IL-6與TIMP-1無線性關(guān)系（PTIMP-1=0.119，rTIMP-1=0.281）。
　　結(jié)論：
　　1不同胎齡FIRS早產(chǎn)兒臍血MMP-9水平及M/T比值均明顯升高，且與BPD及心肌損傷發(fā)生率相關(guān)，提示MMP-9升高及M/T比值紊亂是FIRS引發(fā)心肺損傷的分子基礎(chǔ)之一，并有望成為早產(chǎn)兒BPD及心肌損傷的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　2 FIRS早

34、產(chǎn)兒臍血中IL-6與MMP-9及M/T呈正相關(guān)，提示在FIRS病程中IL-6與MMP-9具有協(xié)同關(guān)系，MMP-9可與炎性介質(zhì)相互作用參與并加重心肺炎癥損傷。
　　3 FIRS可引發(fā)小鼠心肺損傷，并上調(diào)組織MMP-9表達(dá)，MMP-9抑制劑可明顯下調(diào)組織中 MMP-9表達(dá)，且使病理改變改善，進(jìn)一步提示MMP-9水平及M/T比值升高是FIRS引發(fā)心肺損傷的分子基礎(chǔ)，而MMP-9抑制劑可在心肺損傷過程中發(fā)揮保護(hù)作用。
　　4 FIR