基于新一代測序技術(shù)的不同慢病毒組合誘導類神經(jīng)元細胞基因表達譜差異研究.pdf

1、目的：傳統(tǒng)理論中終末分化的細胞是不可逆的過程，不能轉(zhuǎn)化為其他已分化細胞。近年來，譜系重編技術(shù)為誘導終末分化細胞功能轉(zhuǎn)化開啟了一道大門，根據(jù)重編程過程的不同分為兩種方式，其中一種是誘導普通成體細胞轉(zhuǎn)化為多能干細胞，再誘導分化為新的細胞類型，稱為間接譜系重編；最新研究提示另一種重編程方法，直接譜系重編分化成熟細胞為其他類型的功能細胞。前期研究成果通過不同的慢病毒組合誘導，黑色素瘤細胞重編程為類神經(jīng)元細胞。這一直接譜系重編過程中是否存在主調(diào)控

2、基因及信號通路，本課題利用新一代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對誘導得到的類神經(jīng)元細胞進行全轉(zhuǎn)錄組測序，研究黑色瘤細胞譜系重編機制，初步探討在誘導過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因及信號通路，為改良譜系重編過程提供理論依據(jù)。
　　方法：譜系重編得到黑色瘤細胞來源的類神經(jīng)元細胞，原始細胞為A375細胞系，誘導過程中設(shè)立3組——4因子組、5因子組和對照組。利用4種已經(jīng)證實能夠誘導成纖維細胞向類神經(jīng)元細胞轉(zhuǎn)化的因子（神經(jīng)母細胞特異性轉(zhuǎn)移因子1(Achaete-s

3、cute homolog1，Ascl1)、成神經(jīng)分化因子1（Neurod1，neuronal differentiation1）、髓鞘轉(zhuǎn)錄因子1（Myelin transcription factor1，Myt1l）、大腦蛋白2（Brain protein2，Brn2，also called POU3F2））誘導A375細胞，5因子組慢病毒組合為Ascl1、Neurod1、Myt1l、Brn2和人腦源性神經(jīng)生長因子（Human brai

4、n-derived neurotrophic factor，h-BDNF），實驗過程中以空載體慢病毒轉(zhuǎn)染細胞作為對照組?；诒菊n題前期實驗成果，誘導得到的類神經(jīng)元細胞在第14天具有最佳的形態(tài)及類神經(jīng)元功能，因此在該時間點收集誘導后細胞，提取RNA上機測序，采用國際公認算法DESeq進行3組實驗組兩兩差異基因的篩選。其中篩選時，設(shè)立Log2FC>0.585或<-0.585，Pvalue<0.05，F(xiàn)DR<0.05為顯著性差異基因。整合NC

5、BI、Swissprot/Uniprot、The Gene Ontology、AmiGO等多個數(shù)據(jù)庫的信息，對差異基因進行GO分析和Pathway分析，根據(jù)相關(guān)文獻選出與細胞分化和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的 GO和 Pahtway進行功能樹分析和信號通路網(wǎng)絡構(gòu)建，找出發(fā)揮關(guān)鍵作用的GO和Pathway，通過趨勢分析確定譜系重編過程中的主調(diào)控基因及信號通路，構(gòu)建基因及信號通路共表達網(wǎng)絡驗證結(jié)果。
　　結(jié)果：本課題利用5種因子不同組合（Asc

6、l1，Neurod1，Myt1l，Brn2，h-BDNF）誘導A375細胞成功向類神經(jīng)元細胞轉(zhuǎn)化。通過深度測序，我們得到4因子組、5因子組及對照組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。在4因子組與對照組之間共有893個差異基因，5因子組與對照組之間共有512個差異基因，同時在4因子組與5因子組之間有409個差異基因。通過對差異基因進行基因注釋，在眾多基因條目中與細胞分化及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的基因條目是顯著上調(diào)的。對信號通路注釋的結(jié)果提示PI3K及MAPK在4因子

7、組和5因子組中均表達上調(diào)，在基因互作網(wǎng)絡中這兩條信號通路的基因處于核心位置，因此可以初步推斷此兩條信號通路在A375細胞譜系重編過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對4因子組及5因子組細胞差異信號通路分析中，證實以上推斷，MAPK在5因子組得到更高的表達，而基因及信號通路共表達網(wǎng)絡中也證實在這兩條信號通路中促生長因子（insulin-like growth factors-1，IGF-1）顯著表達，是譜系重編過程中主調(diào)控基因之一。
　　結(jié)論：黑色