p16蛋白對喉癌生長的抑制和對自然殺傷細(xì)胞抗腫瘤免疫的調(diào)控.pdf

1、喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，其主要的病理類型為鱗狀細(xì)胞癌。
　　本課題將研究p16蛋白對人喉癌細(xì)胞系Hep-2生長的影響，并從細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期兩個方面進(jìn)行機制探討。還將初步探討Hep-2細(xì)胞的p16蛋白導(dǎo)入與機體NK細(xì)胞抗腫瘤作用之間的關(guān)系，為p16作為腫瘤治療靶點的應(yīng)用提供更為詳實的理論依據(jù)。
　　目的:
　　1.擴(kuò)增攜帶野生型p16基因的重組腺病毒載體，并導(dǎo)入人喉癌細(xì)胞Hep-2中，觀察p16蛋白的表達(dá)情況。

2、r>　　2.觀察表達(dá)野生型p16蛋白的人喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖情況，并從細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期兩方面探討其作用機制。
　　3.初步探討表達(dá)野生型p16的人喉癌Hep-2細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷敏感性的變化，同時觀察該細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷活性的調(diào)控作用。
　　方法:
　　第一部分 重組腺病毒載體的擴(kuò)增及其感染喉癌細(xì)胞Hep-2后p16蛋白的表達(dá)情況
　　利用人胚腎細(xì)胞系HEK-293擴(kuò)增攜帶野生型p16基因的重組腺病毒載體;

3、采用293細(xì)胞空斑試驗測定重組腺病毒的滴度;重組腺病毒感染Hep-2細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot法檢測p16蛋白的表達(dá)情況。
　　第二部分 野生型p16蛋白對人喉癌細(xì)胞Hep-2體外生長和體內(nèi)生長的影響
　　采用CCK8法檢測p16蛋白對Hep-2細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀檢測p16蛋白對Hep-2細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響;采用電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài);采用Q-PCR法檢測相關(guān)細(xì)胞凋亡蛋白和細(xì)胞周期

4、蛋白的基因表達(dá)情況;Hep-2細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下，采用重組腺病毒瘤內(nèi)注射的方式觀察p16蛋白體內(nèi)抑瘤作用;采用Tunnel法檢測瘤體組織的細(xì)胞凋亡情況。
　　第三部分 野生型p16蛋白對人喉癌細(xì)胞Hep-2與NK細(xì)胞之間相互作用的影響
　　采用CCK8法檢測p16導(dǎo)入后喉癌Hep-2細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷敏感性的情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測p16導(dǎo)入后Hep-2細(xì)胞表面NK活化受體配體的表達(dá)情況;qRT-PCR檢測p16導(dǎo)入后Hep

5、-2細(xì)胞IL-6、IFN-γ、IL-10和TGF-β的基因表達(dá)情況;ELISA檢測p16導(dǎo)入后Hep-2培養(yǎng)上清中TGF-β的分泌情況;p16蛋白導(dǎo)入后Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育NKL細(xì)胞，CCK8法檢測該NKL對Hep-2細(xì)胞的殺傷情況;采用添加或阻斷的TGF-β方式，確認(rèn)Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清的TGF-β是否參與了對NK細(xì)胞殺傷功能的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果:
　　第一部分 重組腺病毒載體的擴(kuò)增及其感染人喉癌細(xì)胞Hep-2后

6、p16蛋白的表達(dá)情況
　　1.利用HEK-293細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病毒載體后，采用293細(xì)胞空斑試驗測定重組腺病毒的滴度，Ad-p16的滴度為6.5×1010，Ad-LacZ的滴度為4.8×1010。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測p16蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示，Ad-p16組Hep-2細(xì)胞感染重組腺病毒3h、6h、12h和24h時p16蛋白的表達(dá)率分別為29.5％、85.0％、92.7％和95.4％。未感染Ad-p16組的Hep-2細(xì)胞中無

7、p16蛋白表達(dá)。
　　3.Western blot檢測結(jié)果也顯示Ad-p16感染的Hep-2有明顯p16蛋白的表達(dá)。
　　第二部分 野生型p16蛋白對人喉癌細(xì)胞Hep-2體外生長和體內(nèi)生長的影響
　　1.Hep-2細(xì)胞感染重組腺病毒24h，48h，72h，96h后，Ad-p16組Hep-2細(xì)胞的增殖抑制率分別為3.003％±0.497(24h)，12.031％±1.946(48h)、24.857％±1.473(72h)

8、和30.35％±1.916(96h)，與Ad-LacZ比較，均有顯著性差異;
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，Ad-p16組Hep-2細(xì)胞凋亡率從24h的9.99％增加到26.98％(48h)和37.87％(72h)，在Ad-LacZ組和Ad-p16組之間進(jìn)行比較，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率24h時無統(tǒng)計學(xué)差異，但48h和72h有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異;
　　3.電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Ad-p16感染的細(xì)胞染色質(zhì)濃縮和明顯的凋亡小體。而Ad-

9、LacZ感染的Hep-2細(xì)胞少見染色質(zhì)濃縮和凋亡小體。
　　4.與Ad-LacZ比較，Ad-p16感染Hep-2細(xì)胞后24h，使其G0/G1期細(xì)胞明顯增加(48.36％)，S期細(xì)胞明顯減少(38.26％)，而G2/M期細(xì)胞無明顯變化;
　　5.與Ad-LacZ組比較，促凋亡基因p53、Caspase-8和Bak在Ad-p16組的表達(dá)上調(diào)，抑凋亡基因Survivin和bcl-2的表達(dá)下調(diào)，均具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，而Bel-xl

10、的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異;
　　6.與Ad-LacZ組相比較，細(xì)胞周期蛋白p21和cyclinD1基因在Ad-p16組的表達(dá)上調(diào)，有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，而E2F2和CDK4基因的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異;
　　7.裸鼠移植瘤實驗結(jié)果顯示untreated組及Ad-LacZ組小鼠腫瘤生長迅速，且體積與時間呈一定線性關(guān)系，兩組在各時間點瘤體體積對比，均無統(tǒng)計學(xué)差異。與Ad-LacZ組比較，Ad-p16治療組的腫瘤體積在12天前均無統(tǒng)計差異，但1

11、6天開始，腫瘤生長緩慢，具有統(tǒng)計學(xué)差異，且24天出現(xiàn)腫瘤生長消退的趨勢;
　　8.喉癌Hep-2細(xì)胞移植瘤組織Tunnel染色結(jié)果顯示，untreated組Tunnel陽性細(xì)胞百分率為30.56％±1.842，Ad-LacZ組為34.44％±2.572，Ad-p16組為71.78％±3.244，可見Ad-p16組腫瘤組織的凋亡程度明顯增高，與Ad-LacZ組比較，p＜0.0001。
　　第三部分 野生型p16蛋白對人喉癌細(xì)胞

12、Hep-2與NK細(xì)胞之間相互作用的影響
　　1.用CCK8法檢測NK細(xì)胞對Hep-2細(xì)胞的殺傷率，結(jié)果顯示，與Ad-LacZ組對比，不同效靶比的條件下，NK細(xì)胞對Ad-p16組Hep-2細(xì)胞的殺傷效率均有不同程度的提高，且具有統(tǒng)計學(xué)差異;
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，Ad-p16組Hep-2細(xì)胞表面NK細(xì)胞活化性受體NKG2D的配體MICA/B和ULBP2的表達(dá)均上調(diào)，與Ad-LacZ比較，均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異;

13、>　　3.采用qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，表達(dá)p16的Hep-2細(xì)胞可下調(diào)IL-10、TGF-β和IL-6的基因表達(dá)，上調(diào)IFN-γ的基因表達(dá)，與Ad-LacZ比較，均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異;
　　4.ELISA檢測結(jié)果顯示，Ad-p16組培養(yǎng)上清中TGF-β的濃度低于另外兩組，且具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異;
　　5.用不同組Hep-2培養(yǎng)上清孵育NKL細(xì)胞后，按照效/靶比4∶1的比例，利用CCK8法檢測NKL的殺傷活性。結(jié)果顯示，

14、單純Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育后的NKL細(xì)胞殺傷Hep-2細(xì)胞的效率為44.80％±1.277，Ad-LacZ處理組的為44.43％±1.241，二者之間無統(tǒng)計學(xué)差異。而Ad-p16組的為77.10％±1.850，與Ad-LacZ組比較，p＜0.0001。
　　6.Ad-LacZ組培養(yǎng)上清添加anti-TGF-β Ab以阻斷TGF-β的作用，結(jié)果顯示，阻斷后NK細(xì)胞的殺傷活性由44.43％±1.241增加到58.33％±1.525

15、，且具有統(tǒng)計學(xué)差異。Ad-p16組培養(yǎng)上清補充TGF-β蛋白，結(jié)果顯示，補充后NK細(xì)胞的殺傷活性由77.10％±1.850減少到58.73％±2.554，且具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1.人喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞缺失p16蛋白的表達(dá)，而重組腺病毒Ad-p16感染Hep-2細(xì)胞后，p16蛋白在該細(xì)胞的表達(dá)率可高達(dá)95％左右，補充了Hep-2細(xì)胞缺失的p16蛋白，重組腺病毒Ad-p16可為下一步的實驗研究提供良好的物質(zhì)基

16、礎(chǔ)。
　　2.野生型p16蛋白在Hep-2細(xì)胞的表達(dá)可使該細(xì)胞體內(nèi)外的生長均受到抑制;野生型p16蛋白可使Hep-2細(xì)胞停滯于G0/G1期，減少細(xì)胞進(jìn)入S期，說明p16蛋白可通過調(diào)控細(xì)胞周期來發(fā)揮其抑瘤作用;野生型p16蛋白可促進(jìn)Hep-2細(xì)胞的凋亡，且呈時間依賴性;電子顯微鏡顯示存在經(jīng)典的細(xì)胞凋亡形態(tài);移植瘤組織Tunnel染色也顯示p16蛋白可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，表明p16蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是其發(fā)揮抑瘤作用的另一機制。
　

17、　3.野生型p16蛋白在Hep-2細(xì)胞的表達(dá)，一方面，引起Hep-2細(xì)胞高表達(dá)NKG2D配體，使其對NK細(xì)胞的殺傷敏感性增加;另一方面，Hep-2細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)生改變，如下調(diào)TGF-β和IL-10，上調(diào)IFN-γ，進(jìn)一步實驗證實p16蛋白引發(fā)的TGF-β的下調(diào)可使NK細(xì)胞的殺傷活性得到提高。
　　意義:
　　通過本課題的研究，初步揭示了在p16蛋白抗腫瘤機制中，存在著兩條不同的作用通路，即抑制腫瘤細(xì)胞自身的生長速度和