基于衰老雌鼠模型探討鐵皮石斛“補(bǔ)腎”功效的科學(xué)內(nèi)涵.pdf

1、傳統(tǒng)中醫(yī)對(duì)石斛功效評(píng)價(jià)很高，《本草通玄》記載石斛“咸能益腎，多功于水土（腎、脾）二臟”;《本草思辨錄》記載石斛為腎藥、為肺藥、為腸胃藥;《神農(nóng)本草經(jīng)》認(rèn)為石斛新鮮或干燥莖入藥，有滋陰清熱、補(bǔ)腎益精之功效;《藥性論》中石斛“主治腰腳軟弱，骨中虛損，補(bǔ)腎積精，養(yǎng)腎氣，益力”;《本草綱目》評(píng)價(jià)鐵皮石斛“強(qiáng)陰益精，補(bǔ)腎益力，壯筋骨，益智除驚，補(bǔ)五臟虛勞羸瘦，輕身延年”;《道藏》更將鐵皮石斛列為“中華九大仙草”之首，因其具有獨(dú)特的藥用價(jià)值和保健功

2、效，成為歷代養(yǎng)生補(bǔ)品，說(shuō)明石斛的延緩衰老作用早已被認(rèn)識(shí)。
　　近來(lái)研究證實(shí)mTOR（mammalian target of rapamycin，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白）通路的調(diào)節(jié)作用與機(jī)體衰老密切相關(guān)，可通過(guò)活化NF-κB、促炎癥因子釋放等而參與炎癥衰老的過(guò)程。線粒體功能紊亂致氧自由基生成增加是衰老調(diào)控機(jī)制之一，線粒體功能受損及數(shù)量減少與諸多年齡相關(guān)疾病密切聯(lián)系。mTORC1受抑制后可致發(fā)揮保護(hù)功能的基因群活化，通過(guò)限制線粒體呼吸

3、減少氧自由基造成的損傷，從而致機(jī)體壽命延長(zhǎng)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛抗雌鼠卵巢衰老的機(jī)制可通過(guò)增強(qiáng)血液中的抗氧化酶活性、抑制促炎癥因子的釋放、抑制NF-κB炎癥通路的活化來(lái)調(diào)控，因此，本研究進(jìn)一步提出“鐵皮石斛可通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路過(guò)度活化，參與調(diào)控線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，改善生殖衰老，從而影響多種老年疾病的相關(guān)進(jìn)程，發(fā)揮“補(bǔ)腎、延年益壽”的作用。
　　目的:
　　基于鐵皮石斛“補(bǔ)腎、延年益壽”的功效及結(jié)合“腎主骨生髓

4、、主藏精、主生殖”的中醫(yī)理論，本研究通過(guò)構(gòu)建去勢(shì)致骨質(zhì)疏松小鼠模型、D-半乳糖致亞急性衰老小鼠及自然衰老小鼠模型，分別探討鐵皮石斛“壯筋骨、益智、強(qiáng)陰益精、補(bǔ)五臟輕身延年”等功效。
　　方法:
　　一、從“腎主骨”的角度探討鐵皮石斛“補(bǔ)腎益力、壯筋骨”的功效
　　昆明小鼠，雌性，1月齡。進(jìn)行去勢(shì)手術(shù)，術(shù)后1個(gè)月將造模組小鼠隨機(jī)分為:去勢(shì)模型組、雌二醇組（0.17 mg/kg）、鐵皮石斛榨汁組（2 g生藥（鮮品）/kg，

5、含多糖約130mg/kg)、鐵皮石斛多糖組(140 mg/kg，含多糖約130mg/kg)，另取同批空白小鼠作為假手術(shù)組，連續(xù)給藥1個(gè)月。檢測(cè)指標(biāo)包括:(1)血清生化指標(biāo):鈣(Ca)、磷(P)、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量;(2)組織病理檢查:子宮組織;(3)骨組織形態(tài)學(xué)觀察:骨組織計(jì)量學(xué)及骨密度考察。
　　二、從“腎生髓”的角度探討鐵皮石斛“益智”的功效
　　昆明小鼠，雌性，1月齡。

6、通過(guò)皮下注射1 g/kg D-半乳糖連續(xù)8周建立D-半乳糖致亞急性衰老小鼠模型，造模2周后隨機(jī)分為D-半乳糖模型組、雌二醇組(0.17mg/kg)、鐵皮石斛榨汁組(2g生藥(鮮品)/kg，含多糖約130mg/kg）、鐵皮石斛多糖組(140mg/kg，含多糖約130mg/kg)。另取同批空白小鼠作為正常組，連續(xù)給藥3個(gè)月。去勢(shì)模型采用上一章節(jié)中同樣造模方法進(jìn)行模型構(gòu)建，術(shù)后6個(gè)月進(jìn)行分組給藥，給藥劑量不變，給藥周期為13個(gè)月。檢測(cè)指標(biāo)包括

7、:(1)行為學(xué)考察:Morris水迷宮實(shí)驗(yàn);(2)臟器病理檢查:腦組織。
　　三、從“腎藏精”探討鐵皮石斛“補(bǔ)五臟、延年益壽”的功效
　　采用第三章第二節(jié)D-半乳糖致亞急性雌性衰老模型小鼠;將9月齡衰老動(dòng)物隨機(jī)分為:自然衰老模型組、鐵皮石斛榨汁組(2g生藥(鮮品)/kg，含多糖約130mg/kg)、鐵皮石斛多糖組(140 mg/kg，含多糖約130mg/kg)，連續(xù)給藥至小鼠全部死亡;野生型黑腹果蠅，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院

8、李耿老師饋贈(zèng)，收集8h內(nèi)羽化的果蠅隨機(jī)分為空白對(duì)照組、3％紅景天組、雌二醇組、1％鐵皮石斛榨汁組、3％鐵皮石斛榨汁組、9％鐵皮石斛榨汁組、0.1％鐵皮石斛多糖組、0.3％鐵皮石斛多糖組、0.9％鐵皮石斛多糖組。將藥液配于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每5天更換培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)至果蠅全部死亡。檢測(cè)指標(biāo)包括:(1)D-半乳糖致亞急性衰老小鼠:體溫變化，臟器病理檢查:心、肝、脾、胸腺、肺、腎、腎上腺，重要臟器線粒體膜電位檢測(cè):腦、脾、胸腺、腎上腺;(2)自然

9、衰老小鼠:體重、體溫變化，壽命觀察;(3)黑腹果蠅:壽命觀察。
　　四、從“腎主生殖”的角度初步探討鐵皮石斛“補(bǔ)腎、強(qiáng)陰益精”功效的作用機(jī)制
　　昆明小鼠，雌性，1月齡。D-半乳糖致亞急性衰老模型采用第三章第二節(jié)中同樣造模方法進(jìn)行模型構(gòu)建，造模兩周后隨機(jī)分為:D-半乳糖模型組、雌二醇組(0.17mg/kg)、鐵皮石斛榨汁組（2 g生藥（鮮品）/kg，含多糖約130mg/kg）、鐵皮石斛多糖組(140mg/kg，含多糖約130

10、mg/kg)，另取同批空白小鼠作為正常組，連續(xù)給藥4個(gè)月。檢測(cè)指標(biāo)包括:(1)臟器病理檢查:子宮及卵巢組織;(2)子宮及卵巢線粒體功能檢測(cè):ATP含量、線粒體膜電位分析及線粒體介導(dǎo)凋亡相關(guān)基因及線粒體融合蛋白-2基因表達(dá)檢測(cè);(3)子宮及卵巢組織mTOR通路相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　一、從“腎主骨”的角度探討鐵皮石斛“補(bǔ)腎益力、壯筋骨”的功效
　　鐵皮石斛能提高血清磷、鈣、堿性磷酸酶含量，對(duì)鈣磷平衡具有一定的

11、調(diào)節(jié)作用，并能降低MDA含量，提高SOD活性，對(duì)子宮組織、骨小梁骨皮質(zhì)變薄、形態(tài)結(jié)構(gòu)性差等病變程度也具有改善作用，榨汁液更能顯著升高子宮系數(shù)，增加骨小梁面積百分比、骨小梁數(shù)目以及降低骨小梁分離度，多糖亦能不同程度地改善上述骨小梁形態(tài)變化，提示鐵皮石斛能促進(jìn)骨形成，可能通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，有效改善氧自由基代謝異常，從而起到抗骨質(zhì)疏松作用。
　　二、從“腎生髓”的角度探討鐵皮石斛“益智”的功效
　　D-半乳糖造模8周后，小

12、鼠血清SOD活性明顯下降，MDA含量明顯升高，表明機(jī)體造成氧化損傷，模型建立成功。去勢(shì)老年小鼠與青年組比較，學(xué)習(xí)能力明顯低下，與去勢(shì)青年小鼠比較差異不明顯，提示經(jīng)過(guò)去勢(shì)手術(shù)后會(huì)對(duì)定位搜索及空間搜索學(xué)習(xí)能力均有一定的影響，進(jìn)一步說(shuō)明雌激素缺乏可以導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能減退、加重腦衰老。在D-半乳糖模型中，與模型組相比，榨汁組潛伏期和搜索距離均明顯縮短，且空間探索實(shí)驗(yàn)中的目標(biāo)象限停留時(shí)間比及游泳距離比均顯著增加，提示鐵皮石斛對(duì)D-半乳糖模型定位航

13、行的學(xué)習(xí)能力有一定增強(qiáng)作用，對(duì)空間探索中的記憶鞏固能力作用更為明顯;在去勢(shì)模型中，鐵皮石斛榨汁液能縮短去勢(shì)初老小鼠搜索距離，對(duì)去勢(shì)初老模型定位航行中的學(xué)習(xí)能力有一定作用，對(duì)去勢(shì)老年模型的學(xué)習(xí)記憶能力改善不明顯。提示鐵皮石斛對(duì)氧化損傷及激素缺失造成的腦記憶功能障礙有一定改善作用，可能通過(guò)清除自由基，改善氧化損傷造成的腦組織神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少及神經(jīng)元纖維纏結(jié)現(xiàn)象，促進(jìn)受損神經(jīng)元的恢復(fù)，提高腦神經(jīng)元的細(xì)胞活力，改善腦組織和延緩腦的老化，從而激

14、發(fā)和提高腦的智能，使動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力提高。但對(duì)激素缺失的老年機(jī)體作用不明顯，提示在激素缺乏及年齡增長(zhǎng)雙重刺激下所導(dǎo)致的腦記憶功能障礙程度較嚴(yán)重，鐵皮石斛對(duì)此改善作用不明顯。
　　三、從“腎藏精”探討鐵皮石斛“補(bǔ)五臟、延年益壽”的功效
　　鐵皮石斛對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老小鼠局部溫度影響并不明顯，而多糖則對(duì)自然衰老小鼠的肩胛部、背部及腹部溫度升高較明顯，表明鐵皮石斛多糖對(duì)老年基礎(chǔ)代謝生命活動(dòng)有一定的增強(qiáng)作用。鐵皮石斛對(duì)D-半乳糖

15、致亞急性衰老雌鼠中各重要臟器病變均有不同程度的改善作用，對(duì)腦、脾臟及腎上腺組織ATP含量有升高的作用，并能明顯升高腦及脾臟組織線粒體膜電位，改善去極化現(xiàn)象，對(duì)臟器的凋亡壞死有一定的保護(hù)作用。在自然衰老小鼠模型及黑腹果蠅模型中，鐵皮石斛平均壽命及半數(shù)死亡時(shí)間均有一定的延長(zhǎng);且以榨汁組在自然衰老小鼠模型中延長(zhǎng)最為明顯。表明鐵皮石斛具有一定補(bǔ)五臟功效及延長(zhǎng)壽命的作用。
　　四、從“腎主生殖”的角度初步探討鐵皮石斛“補(bǔ)腎、強(qiáng)陰益精”功效的

16、作用機(jī)制
　　鐵皮石斛可升高子宮系數(shù)，改善子宮萎縮現(xiàn)象;臟器病理檢查分析表明能改善子宮、卵巢等病理變化。鐵皮石斛可升高雌性衰老小鼠子宮及卵巢組織ATP含量，通過(guò)下調(diào)卵巢組織Mfn2、上調(diào)子宮及卵巢組織Bcl-2、下調(diào)子宮組織Bax基因表達(dá)水平，增加Bcl-2/Bax的表達(dá)比率，保護(hù)線粒體膜并升高線粒體膜電位，緩解D-半乳糖對(duì)子宮及卵巢組織線粒體的損傷，抑制子宮及卵巢組織的凋亡從而延緩衰老。鐵皮石斛對(duì)卵巢組織mTOR基因表達(dá)水平也具

17、有下調(diào)作用，但目前對(duì)mTOR信號(hào)通路的了解不十分完全且細(xì)胞凋亡機(jī)制尚未研究明確，因此鐵皮石斛是否通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路發(fā)揮抗凋亡保護(hù)作用仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。
　　結(jié)論:
　　本研究以鐵皮石斛為研究對(duì)象，采用去勢(shì)致骨質(zhì)疏松小鼠模型、D-半乳糖致亞急性衰老小鼠模型、自然衰老小鼠模型及黑腹果蠅模型，從“腎主藏精、主骨、生髓、主生殖”多角度探討鐵皮石斛“強(qiáng)陰益精、壯筋骨、益智、補(bǔ)五臟、輕身延年”等功效，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛可能通過(guò)補(bǔ)益腎