磁性納米分子PEG-Mn-BDA選擇性抑制腫瘤的線粒體機(jī)制及其熒光和核磁共振成像的初步研究.pdf

1、背景：
　　腫瘤是死亡的主導(dǎo)原因。由于人口的增長和衰老，特別是占世界人口82％的發(fā)展中國家，腫瘤問題日益嚴(yán)重。盡管臨床使用的化療藥物很多，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，需要我們繼續(xù)努力研發(fā)新藥。目前的抗腫瘤藥物療效不夠理想，副作用較強(qiáng)，較易耐受，且腫瘤早期診斷困難，腫瘤組織與正常組織的邊界不易區(qū)分等，腫瘤治療與診斷仍然困難重重。
　　目的：
　　基于Mn-dpa和m-BDA在腫瘤細(xì)胞抑制和成像中的初步結(jié)果，采用納米技術(shù)將Mn-dpa和

2、m-BDA合成為多功能納米材料PEG-Mn-BDA；檢測PEG-Mn-BDA抗腫瘤作用及副作用；研究PEG-Mn-BDA選擇性抗腫瘤效應(yīng)的線粒體機(jī)制；檢測PEG-Mn-BDA能否在腫瘤中熒光成像和核磁成像。進(jìn)一步研究，有望研發(fā)同時具備腫瘤的治療和診斷作用新型藥物。
　　方法：
　　I.將PEG-NHCH2COOH與MnCl2.4H2O和m-BDA反應(yīng)合成PEG-Mn-BDA。透射電鏡（TEM）觀察納米制劑的形態(tài)，粒度儀檢測粒

3、徑，紅外和紫外光譜鑒定結(jié)構(gòu)，原子吸收光譜檢測PEG-Mn-BDA中錳的含量。
　　II.以不同濃度的PEG-Mn-BD處理腫瘤細(xì)胞株及正常細(xì)胞株，MTT法檢測細(xì)胞活性，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，MDC染色熒光顯微鏡觀察自噬。Western blot檢測細(xì)胞死亡、增殖、轉(zhuǎn)運等相關(guān)蛋白的表達(dá)；JC-1或羅丹明檢測線粒體膜電位、熒光素酶法檢測ATP含量、DCFH-DA檢測活性氧（ROS）

4、水平，分析線粒體的功能；乳酸脫氫酶（ LDH）試劑盒檢測LDH活性，分析PEG-Mn-BDA對腫瘤細(xì)胞糖酵解的影響。
　　III.激光共聚焦顯微鏡觀察熒光成像，Trio3.0 T磁共振成像儀觀察磁共振成像.
　　IV.采用肝癌小鼠荷瘤模型，初步檢測了PEG-Mn-BDA的抑瘤作用和毒副作用。
　　結(jié)果：
　　1.Adpa-Mn以時間和劑量依賴性方式抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活性，效果比順鉑更好。其腫瘤細(xì)胞的選擇性作用與膠質(zhì)

5、瘤細(xì)胞上表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體有關(guān)。Adpa-Mn通過靶向線粒體，引起線粒體膜電位去極化并減少ATP的產(chǎn)生，Adpa-Mn能誘導(dǎo)促凋亡蛋白caspase3,caspase7和caspase9高表達(dá)，并顯著降低抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測表明，Adpa-Mn能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但是Adpa-Mn誘導(dǎo)的自噬與抗腫瘤機(jī)制無關(guān)。
　　2.m-BDA可以時間和劑量依賴性方式選擇性抑制SMMC-7721，HCT-116和HepG

6、2細(xì)胞。在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn) m-BDA有熒光信號，分布于胞漿，不入細(xì)胞核。m-BDA通過靶向線粒體，引起線粒體膜電位去極化，增加caspase3表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。m-BDA也能抑制LDH-A，使其表達(dá)及活性降低。m-BDA通過抑制LDH-A，導(dǎo)致丙酮酸進(jìn)入線粒體，從而增加ROS誘導(dǎo)凋亡。m-BDA在低氧環(huán)境下比常氧環(huán)境有更強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用。
　　3.成功合成了PEG-Mn-BDA。透射電鏡觀察和粒徑儀檢測顯示PEG-Mn

7、-BDA粒徑大小在200納米左右。PEG-Mn-BDA仍然具有Adpa-Mn和m-BDA的抗腫瘤特性，即PEG-Mn-BDA可以時間和劑量依賴性方式選擇性抑制腫瘤細(xì)胞SMMC-7721、HCT-116和 HepG2細(xì)胞的增殖。PEG-Mn-BDA對腫瘤的抑制作用比 m-BDA略高，PEG-Mn-BDA也分布于腫瘤細(xì)胞胞漿，但熒光較m-BDA弱一些。PEG-Mn-BDA也能夠在腫瘤細(xì)胞中核磁共振成像，即可以在腫瘤細(xì)胞雙模成像。PEG-Mn

8、-BDA也能夠抑制LDH-A表達(dá)及活性。而且，PEG-Mn-BDA能增加細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，增加促凋亡蛋白caspase3表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PEG-Mn-BDA也可使線粒體膜電位降低，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PEG-Mn-BDA在低氧環(huán)境下能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞增殖的抑制作用更強(qiáng)。在體實驗表明，PEG-Mn-BDA具有抑制肝癌移植瘤細(xì)胞生長，且副作用較低，提示PEG-Mn-BDA有望成為較好的抗腫瘤藥物。
　　結(jié)論：
　　我們的研究表明，成