含色氨酸的陽離子抗菌肽抗炎作用機(jī)制的研究.pdf

1、炎癥是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜主要成分脂多糖(LPS)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種機(jī)體反應(yīng)。長期以來抗生素的濫用不僅導(dǎo)致大量多藥耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，而且抗生素在體內(nèi)殺死細(xì)菌的同時(shí)，大量釋放LPS，進(jìn)一步激發(fā)炎癥因子如IL-6、TNF-α等的釋放，造成機(jī)體二次傷害，導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生?？咕姆肿恿啃?，不易產(chǎn)生耐藥性，還具有抗菌，抗腫瘤及抗炎等特點(diǎn)，是新發(fā)現(xiàn)的一種可代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素的藥物。本實(shí)驗(yàn)室以從中國林蛙皮膚分泌物中提取出的天然抗菌肽Temporin-1CEb為模

2、板設(shè)計(jì)合成了L-K6，并進(jìn)一步在L-K6氨基端1、4、5、11和12位置通過氨基酸替換，合成一系列的含有Trp的抗菌肽I1W、14W、L5W、L11W、L12W、I1WL5W和I4WL5W。前期研究發(fā)現(xiàn)其具有很好的殺菌活性，并且?guī)?個(gè)凈正電荷，本研究以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為細(xì)胞模型，探究含色氨酸的陽離子抗菌肽抗炎作用機(jī)制。
　　首先測定含色氨酸的陽離子抗菌肽對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞毒性，選取細(xì)胞存活率大于50％

3、的抗菌肽濃度10-20μM進(jìn)行炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。其次用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示含色氨酸的陽離子抗菌肽對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放都有一定的抑制作用，其中I1W、I4WL5W和L5W抑制效果最好，L-K6較差。實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明這些含色氨酸抗菌肽抗細(xì)菌和抗腫瘤細(xì)胞的作用靶點(diǎn)是細(xì)胞膜，通過破壞細(xì)胞膜的通透性而殺死細(xì)菌或腫瘤細(xì)胞。為了進(jìn)一步探究含色氨

4、酸的陽離子抗菌肽抗炎作用機(jī)制，我們選取了I1W、I4WL5W和L5W三種肽作為實(shí)驗(yàn)材料，L-K6做陰性對照，通過PI染色、細(xì)胞跨膜電位和共聚焦實(shí)驗(yàn)來探究這四種抗菌肽對RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性的影響，結(jié)果顯示抗菌肽對細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞膜并沒有破壞作用，而是透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中。通過RT-qPCR和Western Blot檢測了抗菌肽對通路蛋白TLR4/MyD88/NF-κB mRNA表達(dá)量和p38/ERK/JNK蛋白表達(dá)量的影響。R

5、T-qPCR結(jié)果顯示:不同抗菌肽對通路蛋白mRNA表達(dá)量均有不同程度的抑制作用，其中對TLR4抑制效果最好的為I4WL5W，對MyD88和NF-κB抑制效果最好的為I1W， L-K6的抑制效果相對其他三種肽較弱。Western Blot結(jié)果表明:抗菌肽對通路蛋白表達(dá)也起到了不同程度的抑制作用。其中對p38和JNK抑制效果最好的為I4WL5W，對ERK抑制效果最好的為I1W，L-K6相對其他三種肽，對通路蛋白表達(dá)抑制效果最弱。