曲安奈德及普萘洛爾對瘢痕疙瘩成纖維細胞體外增殖的研究.pdf

1、背景：
　　瘢痕疙瘩(keloid,KD)是皮膚受損后形成的一種病理性瘢痕，臨床上以疼痛、瘙癢等感覺異常為主要表現(xiàn)，呈進行性生長，并逐漸侵襲周圍正常組織，單純切除后復發(fā)率較高，并且新生瘢痕可能超過原有瘢痕，這與良性腫瘤有很大的相似之處。其在組織學上，KD主要表現(xiàn)為成纖維細胞（Fibroblasts）的過度增生以及細胞外基質膠原過度聚集為特征，在皮膚受到創(chuàng)傷后，在正常情況下處于靜止狀態(tài)的成纖維細胞被激活并大量增殖。與此同時成纖維細胞

2、合成大量的膠原并可以產生多種修復因子促進組織的愈合與修復。以致局部組織過度膠原纖維化，形成蟹足樣外觀，給患者造成一定的心理負擔，發(fā)生在關節(jié)等處的KD還會在某種程度上導致患者的功能障礙。
　　目前，治療瘢痕疙瘩的機制主要有減少和抑制瘢痕組織中成纖維細胞的增殖以及膠原的合成、抑制成纖維細胞的DNA合成促進其凋亡、增強膠原酶的活性促進膠原的降解等。有關研究表明：瘢痕疙瘩的形成、發(fā)生以及發(fā)展過程中，一些細胞因子及其相關受體表達異常，例如：

3、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等。這些相關因子中TGF-β1是目前為止較為確切的因子，在創(chuàng)傷發(fā)生后，TGF-β1首先高水平表達于新生的血管中，進而激活周圍的成纖維細胞并使其高表達

4、TGF-β1,而TGF-β1在促進成纖維細胞增殖的同時，并能夠刺激Ⅰ,Ⅲ膠原為主的多種細胞外基質（extracellular matrix,ECM）蛋白的分泌,使ECM過度沉積，從而形成瘢痕疙瘩。
　　除此之外，瘢痕疙瘩成纖維細胞除了合成和分泌大量膠原蛋白外，在修復創(chuàng)傷的過程中，在缺氧微環(huán)境下，瘢痕疙瘩成纖維細胞可促進VEGF, AngⅠ等血管因子的表達增加，并誘導和促進血管內皮細胞形成血管的能力增強，這些促血管生長因子可能是造成

5、瘢痕疙瘩呈侵襲性生長的一個重要原因，而 VEGF是目前已知的血管生成因子中活性最強的，可以增強血管內細胞的活性并促進其分裂增殖，從而促進瘢痕疙瘩組織內部的血管密度增加，進而為瘢痕疙瘩的向外周正常組織的侵襲提供豐富血供。
　　曲安奈德（triamcinolone acetonide，TA），是目前臨床上治療瘢痕疙瘩的首選藥物,主要是利用其強大的抑制炎癥反應能力和抑制瘢痕組織成纖維細胞增殖的作用，可減輕非感染性和感染性炎癥早期的組織充

6、血、細胞反應及液體滲出等癥狀，并抑制組織愈合過程中肉芽組織的形成以及瘢痕過度生長。
　　普萘洛爾（Propranolol，P）作為治療心血管疾病常用的β受體阻滯劑。2002年O’Callaghan CJ發(fā)現(xiàn)其具有抗纖維化和抑制膠原蛋白形成的效果，作用機制主要是通過競爭性抑制TGF-β1受體，進而抑制成纖維細胞的生物活性，減少膠原的分泌，從而達到抗纖維化的作用。此外，普萘洛爾可能通過抑制ERK/MARK信號通路，從而使增殖期血管瘤V

7、EGF的分泌減少。在血管瘤后期的治療過程中，普萘洛爾可以通過下調MAPK信號通路，從而抑制VEGF和bFGF的表達，進而促進血管瘤的進一步消退。而瘢痕疙瘩的形成離不開成纖維細胞的增殖以及膠原的沉積，亦離不開豐富的血供。2010年,DE Mesquita CJ提出了用普萘洛爾治療瘢痕疙瘩的假說,目前關于普萘洛爾治療瘢痕疙瘩的研究較少。此外，雖然曲安奈德治療瘢痕疙瘩是目前臨床上藥物治療瘢痕疙瘩的首選，但濃度仍然沒有達成統(tǒng)一的標準。
　

8、　目的：
　　1.本實驗擬以體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞為研究對象，探討不同濃度的普萘洛爾及曲安奈德對瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖及Ⅰ、Ⅲ型膠原、TGF-β1及VEGF的表達；
　　2.篩選出普萘洛爾與曲安奈德抑制成纖維細胞增殖的有效藥物濃度，比較兩者藥效之間的不同。
　　3.為普萘洛爾在臨床防治瘢痕疙瘩中的應用提供實驗理論依據。
　　方法：
　　1.標本來源為臨床瘢痕疙瘩患者，并經鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科證實

9、為KD。
　　2.采用兩步胰蛋白酶消化法，提取瘢痕疙瘩成纖維細胞，并在體外原代貼壁培養(yǎng)，傳代純化。
　　3.取傳代培養(yǎng)至第三代，生長良好的瘢痕疙瘩成纖維細胞，利用免疫細胞組織化學技術，檢測CD73, CD90和CD105間充質干細胞表面標記物，在瘢痕疙瘩成纖維細胞的表達，對成纖維細胞進行鑒定。
　　4.用不同濃度(0mg/ml,0.05mg/ml,0.10mg/ml,0.20mg/ml,0.40mg/ml,0.80mg

10、/ml,1.6mg/ml,3.2mg/ml,6.4mg/ml)的普萘洛爾及曲安奈德處理瘢痕疙瘩成纖維細胞24h,48h,72h；不加藥培養(yǎng)基為陰性對照。
　　5.采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測普萘洛爾及曲安奈德對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和活力的影響。
　　6.采用蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測其TGF-β1, VEGF,Ⅰ,Ⅲ型膠原蛋白的表達。采用SPSS17.0軟件對實驗數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。
　　結

11、果：
　　1.瘢痕疙瘩成纖維細胞的鑒定
　　光鏡下，觀察瘢痕疙瘩成纖維細胞的形態(tài)，以長梭形為主，胞體外圍有突起，細胞核呈橢圓形并位于胞體中間，呈平形狀、放射狀生長，結合成纖維細胞形態(tài)學特征、生長特性及成纖維細胞表面的CD73, CD90, CD105的表達，并聯(lián)系臨床診斷，確認所培養(yǎng)的細胞是瘢痕疙瘩成纖維細胞。
　　2.曲安奈德及普萘洛爾對瘢痕疙瘩成纖維細胞的影響
　　2.1 MTT法顯示：
　　2.1.1

12、 曲安奈德在一定濃度下對瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖有明顯的抑制作用，并且抑制作用有明顯的時間和濃度依賴性。在0.05mg/ml~6.4mg/ml范圍內，曲安奈德濃度越高，對成纖維細胞的生長抑制率越高（P＜0.05）；隨著藥物時間的延長，其抑制率越高（P＜0.05）。24h,48h,72h的IC50分別為5.2mg/ml,3.88mg/ml,1.91mg/ml，選用72h的IC50作為藥物試驗濃度。
　　2.1.2 普萘洛爾在一定濃度

13、下對瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖能力具有抑制作用，并且抑制作用有明顯的濃度和時間依賴性。在0.05mg/ml~6.4mg/ml范圍內，普萘洛爾濃度越高，對成纖維細胞的生長抑制率越高（P＜0.05）；隨著藥物作用時間的延長，其抑制率越高（P＜0.05）。24h,48h,72h的IC50分別為6.2mg/ml,4.92mg/ml,2.84mg/ml，選用72h的IC50作為藥物試驗濃度。
　　2.2 Western Blot法顯示

14、　　曲安奈德及普萘洛爾均對瘢痕疙瘩成纖維細胞的Ⅰ,Ⅲ膠原及 TGF-β1, VEGF的表達均有明顯抑制作用。
　　結論：
　　1.曲安奈德及普萘洛爾對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞均有明確的抑制作用，其作用強弱有所不同，整體來看，曲安奈德對瘢痕疙瘩成纖維細胞的抑制作用大于普萘洛爾，兩者之間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2.曲安奈德及普萘洛爾均可抑制 TGF-β1, VEGF表達,Ⅰ及Ⅲ型膠原的分泌，除了 VE