非小細(xì)胞肺癌對12C6+重離子的輻射敏感性及其分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制.pdf

1、肺癌以高發(fā)病率、高致死率和低治愈率的特點(diǎn)位居惡性腫瘤榜首。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌(SCLC)兩類，其中NSCLC占肺癌患者總數(shù)的85％，并且五年生存率僅為17.1%。大量研究發(fā)現(xiàn)NSCLC輻射敏感性較低，且具有較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，因此傳統(tǒng)放射治療(X-射線和γ-射線)的療效較差。輻射敏感性低意味著細(xì)胞的抗輻射損傷能力強(qiáng)，放射治療的效果差，提高輻射敏感性有望提高放射治療的效果。近些年來發(fā)現(xiàn)，重離子作為一種新的輻射源在

2、腫瘤治療方面有較好的應(yīng)用前景。然而，關(guān)于NSCLC對重離子的輻射敏感性及其分子機(jī)制，目前還不清楚。為此，本研究以腺癌 A549、大細(xì)胞癌 PGCL3和鱗癌H520三個不同的NSCLC細(xì)胞株為對象，分析了它們對重離子的輻射敏感性及其分子機(jī)制，同時以X-ray照射為參照，比較了它們對12C6+重離子與X-ray的輻射敏感性及其差異。主要結(jié)果如下：
　　1.以上三種 NSCLC細(xì)胞株經(jīng)12C6+和 X-ray照射后，克隆形成實(shí)驗和RT-

3、CES檢測結(jié)果顯示，與未經(jīng)照射的細(xì)胞相比，無論是經(jīng)12C6+還是X-ray照射，a)三個細(xì)胞株的存活分?jǐn)?shù)（SF）和增殖能力均顯著下降，并且下降的幅度與照射劑量成正相關(guān)；b）H520的SF和增殖能力都始終最低，A549的最高。PGCL3的居中（H520

4、未經(jīng)輻照的細(xì)胞相比，無論是經(jīng)12C6+或X-ray照射，a）三個細(xì)胞系G2/M期細(xì)胞的數(shù)量和凋亡細(xì)胞的數(shù)量均顯著增多，并且隨劑量的升高呈上升趨勢；b）H520的G2/M期阻滯率和凋亡率都始終高于PGCL3和A549的G2/M期阻滯率和凋亡率，PGCL3的G2/M期阻滯率和凋亡率始終高于 A549的G2/M期阻滯率和凋亡率（H520>PGCL3>A549）。此外，相同劑量下，12C6+照射后G2/M阻滯率和凋亡率顯著高于 X-ray照射后

5、 G2/M阻滯率和凋亡率。以上結(jié)果說明，不同類型的NSCLC對12C6+和X-ray的輻射敏感性不同，同種NSCLC對12C6+的輻射敏感性顯著大于對X-ray的輻射敏感性。
　　2.三種 NSCLC細(xì)胞株經(jīng)12C6+和 X-ray照射后，RT-qPCR和 western blot分析結(jié)果顯示，與未經(jīng)照射的細(xì)胞相比，無論是經(jīng)12C6+還是X-ray照射后。a）三個細(xì)胞株內(nèi)DNA-PKcs的表達(dá)水平均顯著提高，但隨著劑量的升高，表達(dá)

6、水平又逐漸顯著下降；b）在A549內(nèi)的表達(dá)水平高于在PGCL3和H520內(nèi)的表達(dá)水平，在 PGCL3內(nèi)的表達(dá)水平又高于在 H520內(nèi)的表達(dá)水平（A549>PGCL3>H520）。同等劑量下，12C6+照射后DNA-PKcs的表達(dá)水平普遍顯著高于X-ray照射后該基因的表達(dá)水平。檢測A549和H520細(xì)胞內(nèi)ATM和ATR的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)照射的細(xì)胞相比，無論是在經(jīng)12C6+離子還是X-ray照射的細(xì)胞內(nèi)，ATM和ATR的表達(dá)水平均顯著

7、上調(diào)，但在A549內(nèi)的表達(dá)水平顯著高于在H520內(nèi)的表達(dá)水平。同等劑量下，12C6+照射后ATM和ATR的表達(dá)水平顯著高于X-ray照射后的表達(dá)水平。以上結(jié)果表明，不同NSCLC細(xì)胞對12C6+和X-ray的輻射敏感性大小與DNA DSB修復(fù)能力呈負(fù)相關(guān)。12C6+照射后細(xì)胞內(nèi)DNA DSBs修復(fù)能力高于X-ray照射后DNA DSBs修復(fù)能力。
　　3．以對12C6+和X-ray敏感性最低的A549細(xì)胞株為對象，照射前0.5 h

8、在培養(yǎng)液中分別加入10μM的DNA-PKcs抑制劑 NU7026（簡稱U）和ATM/ATR抑制劑CGK733（簡稱G），然后經(jīng)等劑量（2 Gy）的12C6+和X-ray照射后，克隆形成實(shí)驗結(jié)果顯示，U+12C6+、U+X-ray、G+12C6+和G+X-ray組細(xì)胞的SF顯著低于對照組（只經(jīng)過12C6+或X-ray照射，下同）的SF，但U+12C6+和G+12C6+組的SF分別低于U+X-ray和G+X-ray組的SF，U+12C6+和

9、U+X-ray組的SF分別低于G+12C6+和G+X-ray組的SF。免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在γH2AX（DSB位點(diǎn)）數(shù)量和G2/M期阻滯率方面，U+12C6+、U+X-ray、G+12C6+和G+X-ray組普遍高于對照組，但U+12C6+和G+12C6+組分別高于U+X-ray和G+X-ray組，U+12C6+和U+X-ray組分別高于G+12C6+和G+ X-ray組。此外，隨著照射后時間的延長，各組γH2AX的數(shù)量和G2

10、/M期阻滯率普遍下降，但U+12C6+和U+ X-ray組凋亡率卻分別高于G+12C6+和G+X-ray組凋亡率。Western blot分析結(jié)果顯示，加入DNA-PKcs抑制劑 NU7026處理后，U+X-ray組內(nèi)ATM和ATR表達(dá)水平較對照組（X-ray單獨(dú)照射）顯著上調(diào)，U+12C6+組內(nèi)ATM和ATR表達(dá)水平較對照組（12C6+單獨(dú)照射）相反的下調(diào)。加入ATM和ATR抑制劑CGK733后，G+12C6+和G+ X-ray組內(nèi)

11、DNA-PKcs表達(dá)水平較對照組都顯著上調(diào)。以上結(jié)果說明，外加DNA-PKcs或ATM/ATR抑制劑，通過抑制細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)活動，可增加NSCLC細(xì)胞對12C6+和X-ray的輻射敏感性，其中NU7026的效應(yīng)大于CGK733的效應(yīng)。
　　4.使用A549細(xì)胞構(gòu)建了BALB/C-nu裸鼠的荷瘤模型。按照25 mg/kg劑量腹腔注射NU7026，0.5 h后分別經(jīng)等劑量（4 Gy）的X-ray和12C6+照射后解剖學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，

12、與對照相比，U+12C6+和U+X-ray組移植瘤的重量、體積、細(xì)胞密度和核漿比都顯著降低，但U+12C6+組移植瘤的重量、體積、細(xì)胞密度和核漿比顯著低于U+X-ray組。RT-qPCR和western blot分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，U+12C6+或U+X-ray組細(xì)胞內(nèi)促凋亡因子基因Bax的表達(dá)上調(diào)，抗凋亡因子基因Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，但U+12C6+組內(nèi)Bax的表達(dá)水平顯著高于U+X-ray組內(nèi)Bax的表達(dá)水平，Bcl-2的表達(dá)水

13、平顯著低于U+X-ray組內(nèi)Bcl-2的表達(dá)水平。以上結(jié)果進(jìn)一步證明外加NU7026處理，通過抑制細(xì)胞損傷的修復(fù)能力，可顯著提高NSCLC細(xì)胞對12C6+和X-ray的輻射敏感性。
　　綜上所述，以上結(jié)果表明，不同的NSCLC細(xì)胞對12C6+或X-ray的輻射敏感性不同；同種NSCLC細(xì)胞對12C6+離子的輻射敏感性高于對X-ray的輻射敏感性；NSCLC細(xì)胞對12C6+或X-ray輻射敏感性的大小都與照射后細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)能