利用大鼠iPSCs和囊胚互補技術(shù)再生肺器官的研究.pdf

1、目的:本課題旨在利用大鼠的誘導多功能干細胞(rat induced pluripotent stem cells，rat iPSCs)技術(shù)和囊胚互補技術(shù)在TTF-1基因敲除的小鼠模型上驗證異種間肺器官再生的可行性。并為最終在豬、猴等大動物體內(nèi)培育出人源化的肺器官奠定基礎(chǔ)。
　　方法:(1)利用N2B27+2i（PD0325901，CHIR99021）的培養(yǎng)體系培養(yǎng)和維持EGFP標記的大鼠iPSCs。(2)采用堿性磷酸酶染色、RT-

2、PCR、細胞免疫熒光、畸胎瘤形成和類胚體形成實驗等驗證大鼠iPSCs的干性。(3)鑒定并繁育TTF-1小鼠，采集TTF-1+/-基因型小鼠雜交的囊胚。應(yīng)用顯微操作技術(shù)，將狀態(tài)較好和干性較強的大鼠iPSCs作為供體細胞進行種間囊胚互補實驗。(4)利用PCR對嵌合小鼠進行基因型鑒定;通過H/E染色對嵌合鼠的肺進行形態(tài)組織學觀測;利用免疫組化檢測EGFP、TTF-1陽性細胞在嵌合小鼠的肺及其它臟器中的分布;利用免疫組化檢測CCSP、SP-C和

3、Foxj1表達，觀測再生肺的發(fā)育和分化情況。
　　結(jié)果:(1)大鼠iPSCs堿性磷酸酶染色呈強陽性;RT-PCR和細胞免疫熒光均檢測到干細胞多能性因子在大鼠iPSCs中的表達;畸胎瘤形成和類胚體形成實驗等證明大鼠iPSCs具有三胚層分化的能力。(2)應(yīng)用顯微操作技術(shù)，成功進行了三次囊胚注射實驗，共注射191枚胚胎，小鼠出生44只，44只出生小鼠中發(fā)生嵌合5只。(3)利用小鼠特異的TTF-1引物對獲得的5只嵌合小鼠進行了基因型鑒定，

4、確定其中一只為TTF-1雙敲小鼠，H/E結(jié)果表明TTF-1雙敲小鼠有再生的肺組織;EGFP、TTF-1免疫組化結(jié)果表明TTF-1雙敲小鼠再生的肺組織來源于大鼠iPSCs; CCSP、SP-C和Foxj1免疫組化的結(jié)果表明再生的肺有克拉拉細胞、肺泡Ⅱ型細胞和終末細支氣管上皮細胞的分化。
　　結(jié)論:應(yīng)用大鼠iPSCs結(jié)合囊胚互補技術(shù)成功在TTF-1敲除的肺發(fā)育缺陷的小鼠模型中再生出大鼠iPSCs來源的肺。實驗結(jié)果表明利用誘導多功能干細